新生隐球菌格鲁比变种国内菌株的多位点微卫星灶分型

目的应用多位点微卫星灶分型(MLMT)对国内6个城市分离出的新生隐球菌格鲁比变种(Cryptococcus neo-formans var.grubii)进行基因分型,了解该变种的国内基因型分布特征。方法提取已鉴定的43株新生隐球菌格鲁比变种DNA,用PCR对3个微卫星位点(CNG1,CNG2,CNG3)的基因片段进行扩增后测序。再计算每一菌株位点基序重复数(CNG1对应TA重复,CNG2对应GA重复,CNG3对应CAT重复);据基序重复数判定各菌株的基因型。结果所有43株菌中,MLMT-17型占83.72%,该型在临床和环境的菌株中分别占86.67%和70%。MLMT-39、-40是新发现的基因型。结论在我国,MLMT-17是最常见的新生隐球菌格鲁比变种基因型,普遍存在于临床和环境菌株中,表明国内临床新生隐球菌病的感染菌株主要源于本土环境菌株。

华东地区新生隐球菌药物敏感性分析

目的探索近年来华东地区分离的新生隐球菌临床株对常用抗真菌药物的体外敏感性。方法采用美国临床实验室标准化协会（CLSI）推荐的M27-A3肉汤微量稀释法检测氟康唑、氟胞嘧啶、两性霉素B、伊曲康唑和伏立康唑对新生隐球菌临床分离株的最低抑菌浓度（MIC）范围,并通过内转录间隔区（ITS）测序法对检测出的耐药和剂量依赖性敏感（SDD）菌株进行进一步鉴定。结果抗真菌药物对96株新生隐球菌的MIC90（MIC范围）为：氟康唑4（0.5~16）μg/m L,氟胞嘧啶4（0.25~64）μg/m L,两性霉素B 0.5（0.03~1）μg/m L,伊曲康唑0.5（0.03~1）μg/m L,伏立康唑0.25（0.03~0.5）μg/m L,所有耐药菌株及SDD菌株的分子鉴定均为新生隐球菌格鲁比变种。结论除伊曲康唑外,华东地区新生隐球菌临床株对抗真菌药物的敏感性高,耐药菌株少,不敏感株以新生隐球菌格鲁比变种为主。

四环素对新生隐球菌胞外磷脂酶作用的研究

目的:比较四环素对自然生长条件下的新生隐球菌新生变种(CZYD7)胞外磷脂酶的抑制作用;观察四环素对CZYD7毒力的影响。方法:在37℃温度下,用蛋黄平板法培养并测量菌株产生的沉淀圈大小,用沉淀圈比值(PZ值)比较磷脂酶活力的变化;建立小鼠感染模型,用菌落形成单位(cfu)及生存期比较菌株毒性的变化。结果:体外实验中,对照组与四环素不同浓度组的PZ值分别为0.387±0.039、0.479±0.086、0.702±0.029、0.891±0.072、0.955±0.021;四环素0.36%、0.54%和0.72%浓度组与对照组的PZ值比较差异有显著性(P<0.001);体内实验中,对照组与四环素0.18%、0.36%和0.54%浓度组小鼠的平均生存期分别为18.90、19.20、26.39、25.94d;小鼠脑组织匀浆培养对照组与四环素不同浓度组(0.18%、0.36%、0.54%)的菌落形成单位分别为518.67±203.86、469.07±243.13、261.73±225.82、226.47±196.13,四环素0.36%组和0.54%组与对照组比较差异有显著性(P<0.01)。结论:体内、外实验中,四环素对CZYD7胞外磷脂酶具有抑制作用,并且与浓度相关,四环素降低了菌株的毒性。

中国和巴西临床新生隐球菌格鲁比变种菌株的种群和基因型比较分析

目的了解新生隐球菌格鲁比变种(Cryptococcus neoformans var.grubii)临床菌株在国内和巴西多位点微卫星位点定型(multilocus microsatellite typing MLMT)的种群分布特征,探讨并分析两国新生隐球菌格鲁比变种MLMT基因型差异。方法对已鉴定的69株新生隐球菌格鲁比变种进行DNA提取,采用3个微卫星位点(CNG1、CNG2、CNG3)的正反序列引物对相应的微卫星位点基因片段进行扩增后测序;测序后计算出每一菌株位点基序重复数(CNG1对应TA重复,CNG2对应GA重复,CNG3对应CAT重复);结合不同基序重复数判定各菌株的基因型。应用SPSS 11.5统计软件进行统计学分析。结果在33株被MLMT基因分型的国内新生隐球菌grubii变种菌株中有5种基因型被鉴定,其中29株为MLMT-17,占87.88%;而在36株巴西临床菌株中有10种基因型被鉴定,其中19株为MLMT-13,占52.78%。结论两国间新生隐球菌格鲁比变种临床菌株的主要基因型分布存在显著差异。巴西临床菌株的基因型分布表现为多样性。

脱氧胆酸钠体外对新生隐球菌胞外磷脂酶的作用

目的比较观察脱氧胆酸钠体外对自然生长条件下的新生隐球菌新生变种(CZYD7)胞外磷脂酶的抑制作用。方法在37℃下,用蛋黄平板法培养并测量菌株产生沉淀圈的大小,用沉淀圈比值(PZ值)比较磷脂酶活力的变化。结果对照组与脱氧胆酸钠不同浓度组(依次为0.1%、0.2%、0.3%和0.4%)的PZ值分别为0.390±0.050,0.782±0.038,0.875±0.074,0.914±0.048,0.885±0.091;脱氧胆酸钠各浓度组与对照组比较均有显著差异(P<0.01)。脱氧胆酸钠不同浓度组间PZ值比较,0.1%和0.2%、0.1%和0.3%、0.1%和0.4%组间有显著差异(P<0.05)。结论脱氧胆酸钠体外对新生隐球菌新生变种CZYD7株胞外磷脂酶具有抑制作用。

新生隐球菌格鲁比变种临床株与环境株微卫星基因型的小鼠毒力实验研究

目的了解巴西新生隐球菌格鲁比变种（C.neoformans var．grubii）多位点微卫星定型（ multilocus microsatllite typing, MLMT）在临床和环境中的分布特点，探讨不同微卫星型的新生隐球菌格鲁比变种临床株和环境株的毒力差异。方法根据多位点微卫星分型技术对分离自巴西的40株（17株临床株和23株环境株）新生隐球菌格鲁比变种进行分型，筛选出临床株及环境株中分布占优势的菌株，应用小鼠毒力试验分别对其进行毒力检测，通过发病情况及病理切片比较毒力差异。结果40株格鲁比变种共鉴定出11种微卫星型，临床株中的优势菌株为MLMT-13型，共9株，占临床株的52．9％（9／17），环境株中的优势菌株为MLMT－36型，共10株，占环境株的43．5％（10／23）；小鼠毒力试验结果显示MLMT－13型感染小鼠后发病率为100％，而MLMT－36型发病率为7．5％，且病理结果也存在明显差异。结论格鲁比变种在从环境迁徙到宿主的过程中，毒力随环境的变化发生了改变，该变化也可在其微卫星重复序列上体现出来。该实验证明新生隐球菌格鲁比变种的分布及来源与微卫星型之间存在相关性，临床株MLMT-13型和环境株MLMT－36型之间存在着显著毒力差异。

新生隐球菌毒力差异菌株的全基因组测序及毒力相关基因的筛选

目的了解及分析新生隐球菌格鲁比变种（Cryptococcus neoformans var grubii）两组毒力差异明显的多位点微卫星型（multilocus microsatellite typing，MLMT）菌株的全基因组序列，筛选出引起其毒力差异的相关基因。方法选取毒力差异最为明显的不同基因型菌株各1株进行全基因组重测序，运用比较基因组学方法全面分析测序结果，使用非同义SNPs（non-synonymous SNPs，nsSNPs）、无义突变SNPs、产生移码突变InDels的策略广泛筛选差异基因。对筛选出的基因在所有实验菌株中进行DNA测序验证，并提取总RNA，采用快速扩增5’和3’cDNA末端（rapidamplificationof5’and3’cDNAends，RACE）技术，克隆后测序获得对应基因的完整cDNA全长序列信息。结果通过全基因组重测序，环境株IFM56731和临床株IFM56800均分别获得127倍和111倍覆盖率的有效数据。分别对SNPs和InDels数据进行统计分析，应用无义突变SNPs和产生移码突变的InDel分别筛选出3个差异基因。对筛选出的6个基因在所有实验菌株中进行扩增测序，并对其中3个基因进行cDNA的测序分析，最终确定基因CNAG_01032的转录序列位置和结构，并验证了预测的无义突变位点存在于实际的mRNA中。结论本研究通过全基因重测序数据分析证明，应用无义突变SNPs和产生移码突变的InDels进行差异基因筛选的策略具有较好针对性，并筛选出6个潜在与毒力相关的基因，通过对所有实验菌株的测序和对全长cDNA的测序验证，最终筛选出基因CNAG一01032为可能引起菌株毒力差异的基因。