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Cloning, sequencing and analyzing of the heavy chain V region genes of human polyreactive antibodies
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作者 ZHANGJINSONG MINGYEH 《Cell Research》 SCIE CAS CSCD 1994年第1期31-46,共16页
The heavy chain variable region genes of 5 human polyreactive mAbs generated in our laboratory have been cloned and sequenced using polymerase chain reaction (PCR) technique. We found that 2 and 3 mAbs utilized genes ... The heavy chain variable region genes of 5 human polyreactive mAbs generated in our laboratory have been cloned and sequenced using polymerase chain reaction (PCR) technique. We found that 2 and 3 mAbs utilized genes of the VHIV and VHIII families, respectively. The former 2 VH segments were in germline configuration. A common VH segment, with the best similarity of 90.1 % to the published VHIII germline genes, was utilized by 2 different rearranged genes encoding the V regions of other 3 mAbs. This strongly suggests that the common VH segment is a unmutated copy of an unidentified germline VHIII gene. All these polyreactive mAbs displayed a large NDN region (VH-D-JH junction). The entire H chain V regions of these polyreactive mAbs are unusually basic. The analysis of the charge properties of these mAbs as well as those of other poly- and mono- reactive mAbs from literatures prompts us to propose that the charged amino acids with a particular distribution along the H chain V region,especially the binding sites (CDRs), may be an important structural feature involved in antibody polyreactivity. 展开更多
关键词 human polyreactive antibody heavy chain variable region gene gene cloning and sequencing polymerase chain reaction (PCR)
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人免疫球蛋白重链可变区基因引物设计方法的改良 被引量:4
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作者 姜晶 孙颖 +2 位作者 刘红艳 牟玲 罗恩杰 《微生物学杂志》 CAS CSCD 2012年第2期60-63,共4页
针对抗体胚系基因数据库的数据不断更新和完善,为获得人全部免疫球蛋白(Ig)重链可变区基因,改进引物设计方法,自主设计针对可变区基因高度保守的框架区1(FR1)和框架区4(FR4)的引物,提取未经免疫的健康人外周血单个核细胞,通过RT-PCR扩... 针对抗体胚系基因数据库的数据不断更新和完善,为获得人全部免疫球蛋白(Ig)重链可变区基因,改进引物设计方法,自主设计针对可变区基因高度保守的框架区1(FR1)和框架区4(FR4)的引物,提取未经免疫的健康人外周血单个核细胞,通过RT-PCR扩增重链可变区基因。其DNA序列与GenBank数据库和IMGT/V-QUEST软件比对,序列分析符合人免疫球蛋白重链基本框架结构,为胚系基因重排产生的序列。多个克隆的测序结果对比分析显示了良好的多样性。获得的重链序列为研制基因工程抗体及构建噬菌体抗体库奠定了物质基础,也为扩增其他物种Ig可变区基因的引物提供新的设计思路。 展开更多
关键词 重链可变区 引物设计 序列分析
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抗端粒酶蛋白hTERT重链可变区基因的克隆和表达 被引量:2
3
作者 张徽 张波 韩继生 《生物医学工程学杂志》 EI CAS CSCD 2002年第3期435-439,共5页
利用噬菌体表面展示技术制备端粒酶蛋白 h TERT抗体。从重组的 h TERT免疫的小鼠脾淋巴细胞中提取总 RNA,逆转录成 c DNA;以逆转录合成的 c DNA第一条链为模板 ,用 VHback和 VHfor引物 ,通过 PCR扩增出约 35 0 bp大小的抗 h TERT重链可... 利用噬菌体表面展示技术制备端粒酶蛋白 h TERT抗体。从重组的 h TERT免疫的小鼠脾淋巴细胞中提取总 RNA,逆转录成 c DNA;以逆转录合成的 c DNA第一条链为模板 ,用 VHback和 VHfor引物 ,通过 PCR扩增出约 35 0 bp大小的抗 h TERT重链可变区基因 ,将其克隆到噬菌粒载体 PCANTAB 5 E中 ,转化入 E.coli TG1宿主菌后 ,在 M13K0 7辅助噬菌体帮助下 ,将 VH与 g3蛋白形成的复合物展示于噬菌体表面。我们利用 Dot Blot检测方法筛选出 h TERT具有亲和性的 VH单功能区抗体。结果提示噬菌体展示技术是制备抗体的一种有效的新途径。抗h TERT VH基因克隆成功 ,为进一步构建单链抗体 Sc 展开更多
关键词 端粒酶 重链可变区 噬菌体表面展示技术 基因克隆 基因表达 hTERT抗体
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从人源单链抗体库中筛出具有抗原结合活性的重链可变区和更小抗体片段 被引量:3
4
作者 胡志伟 段招军 +3 位作者 朱建高 周国华 胡锦跃 孙去病 《中国免疫学杂志》 CAS CSCD 北大核心 1999年第4期148-150,共3页
目的:用噬菌体呈现技术结合体外致敏法构建了人源单链抗体库,并用大肠癌相关抗原CAHb3筛选出抗大肠癌噬菌体抗体克隆EL5D、EL6D和Ca12,测定3个克隆的核苷酸序列,并研究其免疫活性。方法:采用抗体克隆扩增、测... 目的:用噬菌体呈现技术结合体外致敏法构建了人源单链抗体库,并用大肠癌相关抗原CAHb3筛选出抗大肠癌噬菌体抗体克隆EL5D、EL6D和Ca12,测定3个克隆的核苷酸序列,并研究其免疫活性。方法:采用抗体克隆扩增、测序分析、免疫组化法测定活性。结果:抗体基因插入片段分别为220、500、500bp。测序结果表明,EL6D和Ca12属VH5DJH4,仅为VH结构亚单位,而EL5D属Vκ的Jκ1,仅为FR3CDR3FR4结构。三者均能与人结直肠癌细胞和组织反应,与其亲本鼠源单抗Hb3的结合特性一致。3个抗体克隆已列入国际基因库,序号为AF051165AF051167。结论:短的人源抗体片段具有潜在临床应用价值。 展开更多
关键词 免疫球蛋白基因 单链抗体库 大肠癌靶向
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人B细胞淋巴瘤独特型DNA疫苗诱导抗肿瘤免疫反应的实验研究 被引量:2
5
作者 仲凯励 张伟京 +3 位作者 原野 吴英 张明伟 毛宁 《中国实验血液学杂志》 CAS CSCD 2003年第6期609-615,共7页
本研究目的在于探讨含人B细胞淋巴瘤免疫球蛋白重链可变区基因片段的DNA疫苗诱导小鼠抗肿瘤免疫反应的情况 ,为人B细胞淋巴瘤疫苗的应用提供基础实验研究资料。本研究通过PCR方法获得人B细胞淋巴瘤细胞系Namalwa膜表面免疫球蛋白重链可... 本研究目的在于探讨含人B细胞淋巴瘤免疫球蛋白重链可变区基因片段的DNA疫苗诱导小鼠抗肿瘤免疫反应的情况 ,为人B细胞淋巴瘤疫苗的应用提供基础实验研究资料。本研究通过PCR方法获得人B细胞淋巴瘤细胞系Namalwa膜表面免疫球蛋白重链可变区 (VH)基因片段 ,同时克隆小鼠单核细胞趋化蛋白 3(MCP 3)作为免疫佐剂分子 ,进一步以重组PCR的方法获得MCP 3和VH基因的融合基因片段 ,构建DNA疫苗重组质粒。在体外以瞬时转染的方法证实以融合基因片段作为抗原基因的DNA疫苗质粒能够在真核细胞中正确表达。DNA疫苗质粒大量提取后免疫小鼠 ,用流式细胞术检测小鼠抗体生成情况 ,并用LDH释放法测定CTL活性以检测抗独特型细胞免疫。结果表明 ,从接种疫苗第 8周开始小鼠体内特异性抗独特型抗体明显升高 ,并且抗体滴度可维持高水平至少至第 2 0周。在DNA疫苗免疫组中 5只免疫小鼠有 3只产生抗体。所诱导的抗体只特异性识别肿瘤细胞表面独特型抗原 ,而不识别人A5 4 9对照细胞。用乳酸脱氢酶释放法未测到明显CTL反应的产生。结论 :以MCP 3与VH的融合作为抗原基因构建的DNA疫苗能够诱导小鼠体内产生抗淋巴瘤细胞的特异性抗独特型抗体 ,为DNA疫苗临床用于人B细胞淋巴瘤治疗提供了初步实验支持。 展开更多
关键词 B细胞 DNA疫苗 免疫球蛋白重链可变区 vh 肿瘤 免疫反应 淋巴瘤 抗体
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三肽囊素抗独特型抗体可变区基因库的建立 被引量:1
6
作者 邬向东 曲悦 +1 位作者 袁汉英 谌南辉 《华中农业大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2003年第4期313-316,共4页
利用抗bursin单克隆抗体免疫SPF来航鸡 ,获得抗独特型抗体的产生细胞 ,从中提取总RNA ,经反转录合成cDNA第一链。以cDNA第一链为模板 ,根据鸡抗体重、轻链基因设计引物 ,进行PCR扩增。在体外成功地扩增出该抗体的可变区重链和轻链基因。
关键词 三肽囊素 抗独特型抗体 可变区基因库 轻链基因 反转录 cDNA第一链 PCR扩增 重链基因 家禽 法氏囊
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鸡源Bursin-ScFv噬菌体展示文库的构建及初步筛选 被引量:1
7
作者 邬向东 曲悦 +2 位作者 谌南辉 王萍 何后军 《畜牧兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2008年第4期488-493,共6页
本研究利用抗三肽囊素(Bursin)单克隆抗体免疫SPF来航鸡,获得产生抗独特型抗体的脾细胞,从中提取总RNA,经反转录合成cDNA第一链。以cDNA第一链为模板,根据来航鸡IgG抗体重链(VH)、轻链(VL)可变区基因FR设计引物,进行PCR扩增。在体外扩... 本研究利用抗三肽囊素(Bursin)单克隆抗体免疫SPF来航鸡,获得产生抗独特型抗体的脾细胞,从中提取总RNA,经反转录合成cDNA第一链。以cDNA第一链为模板,根据来航鸡IgG抗体重链(VH)、轻链(VL)可变区基因FR设计引物,进行PCR扩增。在体外扩增出该抗体的可变区VH和VL基因(大小分别约为370和320 bp)。通过重叠延伸反应(SOE),以(Gly4Ser)3为连接肽,将VH和VL基因连接成为VH-Linker-VLScFv,将ScFv DNA与噬菌粒载体pHEN1的连接产物转化于大肠杆菌TG1,经辅助噬菌体M13K07感染后,获得重组的鸡源抗三肽囊素独特型抗体全套单链噬菌体抗体库。并测得该库容量约为5×105,噬菌体中ScFv基因的插入率为80%,用辅助噬菌体援救后,得到滴度为1011PFU/mL的初级噬菌体抗体库。用抗Bursin单克隆抗体(2F9-4/HU2)进行4轮"吸附-洗脱-扩增"的淘筛,出现特异性富集。经ELISA、动物试验表明所筛选的5个阳性克隆可与抗Bursin单克隆抗体(2F9-4/HU2)特异性结合,并能促进抗体的生产。 展开更多
关键词 三肽囊素 抗独特型抗体 可变区 重链 轻链 单链抗体 单克隆抗体 噬菌体抗体库
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从兔外周血直接克隆IgG重链可变区 被引量:1
8
作者 周世权 廖智 +2 位作者 杨林 周吉航 刘晓光 《解剖学报》 CAS CSCD 北大核心 2012年第6期762-766,共5页
目的从兔外周血总RNA中直接扩增出IgG重链可变区基因。方法先从IMGT/GENE-DB数据库中获取编码大耳白兔免疫球蛋白(Ig)重链可变区(VH)的3个胚系基因片段VH(IGHV)、D(IGHD)和JH(IGHJ),以及编码γ重链恒定区(CH)基因Cγ(IGHG)的cDNA序列,... 目的从兔外周血总RNA中直接扩增出IgG重链可变区基因。方法先从IMGT/GENE-DB数据库中获取编码大耳白兔免疫球蛋白(Ig)重链可变区(VH)的3个胚系基因片段VH(IGHV)、D(IGHD)和JH(IGHJ),以及编码γ重链恒定区(CH)基因Cγ(IGHG)的cDNA序列,然后设计嵌套引物,以兔外周血总RNA为模板,进行RT-PCR和Nested-PCR扩增,产物经胶回收后克隆到T载体,随机挑选白色克隆测序,最后将序列用Bioedit软件的Local Blast功能比对出Cγ的基因型,同时提交到IMGT/V-QUEST分析出所属的VH、D和JH胚系基因。结果获得25个克隆的插入子序列,每个克隆均为兔IgG重链可变区的编码基因,且包含了完整的VH、D、JH胚系基因片段,以及Cγ基因第1个外显子(CH1)序列的5’端部分,但没有任何2个克隆的序列完全相同。37个IGHV功能基因出现了2个;11个IGHD功能基因出现了8个;11个IGHJ功能基因出现了4个。VH-D-JH组合方式共出现18种,即使VH-D-JH组合方式相同,序列仍具有明显的差异。结论从兔外周血总RNA中直接扩增出了IgG重链可变区,自行设计的引物显示出了高度的特异性和良好的兼并性。 展开更多
关键词 外周血 免疫球蛋白 重链 可变区 反转录-聚合酶链反应 序列分析
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抗猪流感病毒HA蛋白单克隆抗体重链基因的克隆及序列分析 被引量:1
9
作者 张新涛 李洪涛 +2 位作者 刘明 刘春国 杜金玲 《中国预防兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2010年第2期151-153,共3页
为获得抗猪流感病毒HA蛋白单克隆抗体(MAb)重链可变区基因,提取MAb杂交瘤细胞8C4总RNA,通过RT-PCR扩增其重链可变区基因。其DNA序列与GenBank数据库和IMGT/V-QUEST软件比对,序列包含CDR1、CDR2、CDR33个高变区,CDR1含GYTFTSYY 8个氨基酸... 为获得抗猪流感病毒HA蛋白单克隆抗体(MAb)重链可变区基因,提取MAb杂交瘤细胞8C4总RNA,通过RT-PCR扩增其重链可变区基因。其DNA序列与GenBank数据库和IMGT/V-QUEST软件比对,序列包含CDR1、CDR2、CDR33个高变区,CDR1含GYTFTSYY 8个氨基酸、CDR2含IYPGDGST 8个氨基酸、CDR3含ARVMIAMDY 9个氨基酸。第22位和96位为骨架区的2个半胱氨酸,形成链内特征性二硫键。该序列符合鼠Ig重链基本框架结构,框架区内无终止密码子,为重排产生的序列。本实验获得的重链序列为研制基因工程抗体奠定了物质基础。 展开更多
关键词 猪流感 重链可变区 序列分析
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三肽囊素抗独特型ScFv噬菌体展示文库的构建 被引量:1
10
作者 邬向东 谌南辉 +3 位作者 李麟 何后军 袁汉英 王萍 《中国预防兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2008年第6期482-485,共4页
利用在体外构建的三肽囊素抗独特型抗体可变区VH和VL基因,通过重叠延伸反应(SOE),以(Gly4Ser)3为连接肽,将VH和VL基因连接成为VH-Linker-VLScFv,且ScFvDNA与噬菌粒载体pHEN1的连接产物转化于大肠杆菌TG1,经辅助噬菌体M13K07感染后,获得... 利用在体外构建的三肽囊素抗独特型抗体可变区VH和VL基因,通过重叠延伸反应(SOE),以(Gly4Ser)3为连接肽,将VH和VL基因连接成为VH-Linker-VLScFv,且ScFvDNA与噬菌粒载体pHEN1的连接产物转化于大肠杆菌TG1,经辅助噬菌体M13K07感染后,获得重组的鸡源抗三肽囊素抗独特型抗体全套单链噬菌体抗体库,并将该抗体库展示在噬菌体表面,以利用噬菌体展示技术的强大筛选能力筛选出与三肽囊素同功能单链抗体(Bursin-ScFv)。 展开更多
关键词 三肽囊素 抗独特型抗体 可变区重链和轻链基因 单链抗体 噬菌体抗体库
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史氏鲟免疫球蛋白重链可变区序列及多样性 被引量:2
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作者 刘红柏 王荻 《动物学报》 SCIE CAS CSCD 北大核心 2006年第3期557-563,共7页
为了研究史氏鲟免疫球蛋白重链可变区基因的组织结构和多样性,采用RTPCR技术从史氏鲟(Acipenserschrenckii)脾脏总RNA中获得了免疫球蛋白重链可变区cDNA克隆,随机挑取31个阳性克隆进行测序。结果表明:所有序列相同率高于75%,前导肽相同... 为了研究史氏鲟免疫球蛋白重链可变区基因的组织结构和多样性,采用RTPCR技术从史氏鲟(Acipenserschrenckii)脾脏总RNA中获得了免疫球蛋白重链可变区cDNA克隆,随机挑取31个阳性克隆进行测序。结果表明:所有序列相同率高于75%,前导肽相同率高于90%,应属于同1个VH家族。其变异主要存在于互补性决定区,特别是CDR3区。在D片段序列中发现大量保守的基因序列(motif)。并发现多个VH基因片段可以共用一个J片段的现象。在基因组DNA重排过程中,VH片段可以与任意的D和J片段结合。此外,史氏鲟免疫球蛋白重链可变区的VH,D和J片段的随机重排外,外切核酸酶作用,以及在重排位点大量N,P片段的插入现象,都大大增加了鲟鱼免疫球蛋白的多样性。 展开更多
关键词 史氏鲟 免疫球蛋白 重链 可变区 多样性
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乙肝免疫球蛋白抗体的多样性 被引量:1
12
作者 周世权 周吉航 +4 位作者 徐岳军 庄晓玲 李翊卫 李世波 刘晓光 《解剖学报》 CAS CSCD 北大核心 2013年第4期479-484,共6页
目的基于重链可变区的编码基因序列对乙肝免疫球蛋白(HBIG)中的IgG抗体进行分类。方法借用文献提供的引物,以HBsAb强阳性健康个体外周血中的总RNA为模板进行RT-PCR和Nested-PCR扩增,通过将产物克隆到T载体、随机挑选测序,分析并统计出... 目的基于重链可变区的编码基因序列对乙肝免疫球蛋白(HBIG)中的IgG抗体进行分类。方法借用文献提供的引物,以HBsAb强阳性健康个体外周血中的总RNA为模板进行RT-PCR和Nested-PCR扩增,通过将产物克隆到T载体、随机挑选测序,分析并统计出插入子的VH-D-JH-Cγ组合方式。结果共获得56个有效克隆,全部为人VH3-D-JH-Cγ序列,可分成49种序列,其中5种序列有2或3个序列完全相同的克隆。4个Cγ功能基因也全部出现,其中IGHG2频率最高(28次);23个VH3功能基因有11个出现,其中频率最高的是IGHV3-23(29次);23个D功能基因有16个出现,其中频率最高的是IGHD1-26(8次);6个JH功能基因则全部出现,其中频率最高的是IGHJ4(33次)。VH3-D-JH组合有33种,频率最高的是IGHV3-23/IGHD1-26/IGHJ4(8次),其中5种与IGHG2拼接,但这5种VH3-D-JH-Cγ2序列仍有明显的差异。结论成功地从HBsAb强阳性健康个体外周血中克隆到由VH3亚家族参与重排的IgG重链可变区序列;初步证实可变区序列不仅在VH3-D-JH-Cγ组合方式上具有极大的多样性,而且在序列上也具有明显的差异性;基于可变区测序对IgG抗体或B细胞进行分类是可行的,但需大大提高挑取克隆的数量或改用新一代大规模测序技术。 展开更多
关键词 乙肝免疫球蛋白 重链 可变区 反转录一聚合酶链反应 DNA测序
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抗癌胚抗原单区抗体的质粒构建及表达 被引量:1
13
作者 李彪 朱承谟 吴祥甫 《上海第二医科大学学报》 CSCD 1999年第2期99-102,109,共5页
目的对抗癌胚抗原单区抗体进行表达研究。方法采用PCR技术将已获得的抗癌胚抗原(CEA)鼠源单克隆抗体E7B10重、轻链可变区基因(VH、VK)进行改造后分别克隆进大肠杆菌表达质粒pET-24α(+)中,并进行表达。结果显示重、轻链可变区... 目的对抗癌胚抗原单区抗体进行表达研究。方法采用PCR技术将已获得的抗癌胚抗原(CEA)鼠源单克隆抗体E7B10重、轻链可变区基因(VH、VK)进行改造后分别克隆进大肠杆菌表达质粒pET-24α(+)中,并进行表达。结果显示重、轻链可变区在大肠杆菌中获得了高效表达,其表达量达到菌体总蛋白的20%与25%,SDS-PAGE和Westernblot图谱显示表达产物分子量为13KD、12KD,与其基因编码蛋白的理论推算值相符。表达产物在胞内主要以不溶性包含体存在。结论经变性和复性处理后,RIA表明重链可变区基因表达产物具有结合其特异性抗原CEA的能力。 展开更多
关键词 癌胚抗原 PCR 基因表达 肿瘤 诊断 治疗 抗体
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抗人小细胞肺癌单克隆抗体的重链变区基因的体外扩增、克隆和序列分析 被引量:2
14
作者 刘健 吴文书 +4 位作者 王斌 潘志美 田培坤 黄震宇 洪锦心 《生物化学杂志》 CSCD 1993年第1期70-75,共6页
本文从抗人小细胞肺癌单克隆抗体杂交瘤细胞中抽提总RNA,合成第一链cDNA,直接用PCR技术(polymerase chain reaction)扩增出351bp的重链变区基因(V_H),克隆至pUCV_(NP)-PCR载体上,经筛选得一批插入片段为351bp的阳性克隆,经核苷酸序列分... 本文从抗人小细胞肺癌单克隆抗体杂交瘤细胞中抽提总RNA,合成第一链cDNA,直接用PCR技术(polymerase chain reaction)扩增出351bp的重链变区基因(V_H),克隆至pUCV_(NP)-PCR载体上,经筛选得一批插入片段为351bp的阳性克隆,经核苷酸序列分析研究,证实已获得了该单克隆抗体的重链可变区基因。 展开更多
关键词 聚合酶链反应 重链变区 嵌合抗体
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新生儿免疫球蛋白重链可变区基因多样性分析 被引量:1
15
作者 毛晓健 肖昕 +1 位作者 熊爱华 周晓光 《现代临床医学生物工程学杂志》 CAS 2004年第1期8-10,共3页
目的 构建不同胎龄新生儿IgH基因指纹图谱 ,探讨新生儿成熟度对IgH基因谱型多样性的影响 .方法提取 2 7~ 42周新生儿RNA、进行RT -PCR反应、6%变性聚丙烯酰胺凝胶电泳和银染显色 ,获得不同胎龄新生儿IgH基因指纹图谱 ,用Tiger凝胶图... 目的 构建不同胎龄新生儿IgH基因指纹图谱 ,探讨新生儿成熟度对IgH基因谱型多样性的影响 .方法提取 2 7~ 42周新生儿RNA、进行RT -PCR反应、6%变性聚丙烯酰胺凝胶电泳和银染显色 ,获得不同胎龄新生儿IgH基因指纹图谱 ,用Tiger凝胶图像分析仪进行曲线转化和分析 .结果 各家族指纹图谱转化后的曲线下面积积分值 ,在 2 8~ 3 2周、3 3~ 3 6周和 3 7~ 42周新生儿之间无差异 ;但胎龄 2 7周新生儿曲线下面积小于胎龄 2 8~ 42周新生儿 .结论  2 8周可能是人类IgH基因谱型发育由不完善到趋于完善的一个转折点 ,2 展开更多
关键词 新生儿 免疫球蛋白 重链可变区 基因多样性 指纹图谱
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扩增抗体重链可变区的一个高效方法
16
作者 王莹 陈葳 +1 位作者 李旭 程兵 《生物医学工程学杂志》 EI CAS CSCD 北大核心 2006年第6期1308-1313,1319,共7页
从杂交瘤细胞或脾细胞中扩增抗体可变区,是构建单链抗体(Single-chainFvfragment,ScFv)、克隆单克隆抗体和研究抗原与抗体相互作用的关键一步。而抗体可变区(Variableregions,Fv)高度变异,扩增相对困难,至今仍是一个难点,有待解决。我... 从杂交瘤细胞或脾细胞中扩增抗体可变区,是构建单链抗体(Single-chainFvfragment,ScFv)、克隆单克隆抗体和研究抗原与抗体相互作用的关键一步。而抗体可变区(Variableregions,Fv)高度变异,扩增相对困难,至今仍是一个难点,有待解决。我们在构建ScFv过程中,发现2株杂交瘤细胞用普通方法难于扩增出抗体重链可变区(Heavy-chainvariableregion,VH)抗体。于是提出了一种多序列比对和简并引物设计算法,并加以实现,设计出通用的鼠源性抗体VH引物;应用上述引物,采用反向多聚酶链反应(Reversepolymerasechainreaction,reversePCR)方法——3'RACE和5'RACE法,准确地扩增出2株杂交瘤细胞的VH基因。该算法很好地解决了引物特异性和最小化问题,具有简单、实现容易的特点,可用于基因家族中未知基因克隆和文库构建中的引物设计。与反向PCR方法结合,提高了难扩增的未知基因的成功率。 展开更多
关键词 抗体重链可变区 算法 反向PCR
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同源比较法克隆单抗CAb-1重链可变区基因
17
作者 杨向民 姚西英 +3 位作者 邢金良 张思河 冯媛 陈志南 《中国生物制品学杂志》 CAS CSCD 2005年第5期382-385,共4页
目的获得抗人大肠癌单抗CAb-1重链可变区VH的准确基因。方法结合生物信息学同源比较分析,利用高兼并的FR15′端处引物扩增的单抗CAb-1的VH基因,并与数据库中序列比对,在同源性最高的抗体序列的信号肽处二次设计引物,用RT-PCR法获得抗体... 目的获得抗人大肠癌单抗CAb-1重链可变区VH的准确基因。方法结合生物信息学同源比较分析,利用高兼并的FR15′端处引物扩增的单抗CAb-1的VH基因,并与数据库中序列比对,在同源性最高的抗体序列的信号肽处二次设计引物,用RT-PCR法获得抗体基因VH的准确序列。结果选定了与已知抗体VH高度同源的序列进行引物设计。凝胶电泳可见预期大小DNA条带。经测序表明,配对于信号肽处的扩增产物不仅与配对于抗体可变区FR1的结果一致,而且也纠正了配对于CAb-1的VH的FR1的兼并引物所引入的氨基酸突变。结论所优化设计的引物能够扩增完整的抗人大肠癌单抗CAb-1重链可变区基因,为小分子工程抗体改造奠定了基础。 展开更多
关键词 重链可变区 兼并引物 FR1区 同源序列 可变区基因 同源比较 单抗 比较法 RT-PCR法 抗体基因
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用聚合酶链反应制备抗端粒酶蛋白重链和轻链可变区基因
18
作者 张徽 张波 +1 位作者 韩继生 侯琳 《重庆医科大学学报》 CAS CSCD 2001年第2期132-134,138,共4页
目的:为了制备抗端粒酶蛋白hTERT可变区基因。方法:采用Ni-NTA树脂层析法从PBKTRT转染的 E.coli JM109阳性菌中分离纯化端粒酶蛋白hTERT,并免疫小鼠。从免疫的小鼠脾脏中提取淋巴细胞中总RNA,逆转录成cDNA,以逆转录合成的cDNA第一... 目的:为了制备抗端粒酶蛋白hTERT可变区基因。方法:采用Ni-NTA树脂层析法从PBKTRT转染的 E.coli JM109阳性菌中分离纯化端粒酶蛋白hTERT,并免疫小鼠。从免疫的小鼠脾脏中提取淋巴细胞中总RNA,逆转录成cDNA,以逆转录合成的cDNA第一条链为模板,分别用VH和VL引物,通过PCR进行扩增。结果:PCR扩增反应产生350bp大小的抗hTERT重链和轻链可变区基因。VH和VL基因片段的获得为进一步制备抗hTERT单功能区抗体(dABs)和单链抗体ScFv奠定了实验基础。结论:提示该方法具有稳定性好,易于重复,扩增后VH和VL量较高的优点。 展开更多
关键词 端粒酶 重链可变区 轻链可变区 聚合酶链反应
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新生儿免疫球蛋白重链可变区基因重排研究
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作者 毛晓健 肖昕 +1 位作者 熊爱华 钱新华 《南方医科大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2007年第12期1901-1904,共4页
目的探讨不同胎龄新生儿免疫球蛋白(Ig)重链可变区(VH)基因重排情况。方法排除宫内感染的新生儿,其中胎龄27周4例,28~32周9例、33~36周12例、37~42周13例,提取其外周血RNA、进行逆转录PCR(RT-PCR)扩增其IgVH基因、6%变性聚丙烯酰胺... 目的探讨不同胎龄新生儿免疫球蛋白(Ig)重链可变区(VH)基因重排情况。方法排除宫内感染的新生儿,其中胎龄27周4例,28~32周9例、33~36周12例、37~42周13例,提取其外周血RNA、进行逆转录PCR(RT-PCR)扩增其IgVH基因、6%变性聚丙烯酰胺凝胶电泳和银染显色。结果各个胎龄VH1~VH7各家族均有多个重排条带表达,同一个VH家族重排基因的平均中分子量在各个胎龄组间差异无显著性。结论27~42周新生儿IgVH基因VH1~VH7家族重排均具有多样性;对同一个VH家族来说,28~42周各胎龄组IgVH基因重排无显著性差异。 展开更多
关键词 新生儿 免疫球蛋白 重链可变区 基因重排
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抗BAFF单克隆抗体轻链和重链可变区基因的克隆及鉴定
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作者 肖黎明 龚玖瑜 +4 位作者 王畅 陈恒悦 栗向东 金伯泉 陈丽华 《细胞与分子免疫学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2012年第1期49-52,共4页
目的:在本实验室成功制备小鼠抗人BAFF单克隆抗体的基础上,通过分子克隆方法获得该抗体可变区基因序列。方法:从1株小鼠抗人BAFF单克隆抗体杂交瘤细胞FMMUB4中提取总RNA,以此为模版反转录成cDNA,用针对小鼠单克隆抗体重链和轻链可变区... 目的:在本实验室成功制备小鼠抗人BAFF单克隆抗体的基础上,通过分子克隆方法获得该抗体可变区基因序列。方法:从1株小鼠抗人BAFF单克隆抗体杂交瘤细胞FMMUB4中提取总RNA,以此为模版反转录成cDNA,用针对小鼠单克隆抗体重链和轻链可变区基因序列的特异性引物分别进行PCR反应,PCR产物连接入载体,经筛选阳性克隆、酶切鉴定后送测序,测序结果进行生物信息学分析。结果:成功克隆了抗BAFF单克隆抗体FMMUB4重链和轻链可变区基因,测序结果证实序列正确。结论:获得了抗BAFF单克隆抗体FMMUB4重链和轻链可变区基因序列,为下一步构建相关基因工程抗体打下良好基础。 展开更多
关键词 BAFF 单克隆抗体 重链可变区基因 基因克隆
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