抗乙型脑炎病毒单克隆抗体轻链可变区基因的分离和鉴别

为了构建抗乙型脑炎病毒的人—鼠嵌合抗体,以分泌抗乙型脑炎病毒单克隆体的51-8杂交瘤细胞株为材料,以J_κ和V_κ为探针,从λEMBL-3为载体构建的基因文库中分离有功能性的轻链可变区基因。经3次复筛得到19个阳性噬菌斑。将阳性噬菌斑的DNA重组体和小鼠肝DNA分别用BamH I酶切后进行分析,在分析的8个重组体中,其中5个含有2.8kb片段,而肝DNA含有8.9kb、5.6kb、3.6kb及3.1kb4个片段,没有2.8kb片段。由于肝DNA的4个片段是未经重排的种系基因,因此可以推断重组体中的2.8kb片段是经过重排的轻链可变区基因。为了进一步鉴定,又从中选出3个含有2.8kb片段的重组噬菌斑,以V_κ和J_κ作探针分别进行点杂交,结果都为阳性,进一步说明了2.8kb片段是经过重排的轻链可变区基因。将这一2.8kb片段克隆到pUC19中,得一重组子,命名为pVLD24。利用pCR扩增技术从pVLD24中扩增出预期的334 bp轻链V基因。综合证实了所鉴别得到的功能性轻链可变区基因是完整的,并且用不同的限制性内切酶绘制了这一功能性基因的酶切图谱。

从兔外周血直接克隆B细胞κ轻链的可变区

目的从兔外周血总RNA中直接扩增出B细胞κ轻链的可变区序列。方法首先从IMGT/GENE-DB数据库中获取大耳白兔Ig胚系基因Vκ(IGKV)、Jκ(IGKJ)和Cκ(IGKC)的cDNA序列、设计引物,然后以非免疫兔外周血总RNA为模板进行RT-PCR扩增,回收产物并克隆到T载体,随机挑选单克隆测序,最终将序列提交到IMGT/V-QUEST,分析出每个克隆的Vκ-Jκ组合,并利用BioEdit的本地Blast程序比较出Cκ的基因型。结果共设计出4对引物,其中引物对RK.C1[4-5-9]无产物,引物对RK.C1[1-2-7]、RK.C1[3-6-8]和RK.C2[1-2-3-4]有产物,分别回收、克隆到T载体后各挑取20个克隆,共获得51个克隆的插入子序列。没有任何2个克隆的插入子序列完全相同,每个克隆均包含完整的兔Vκ、Jκ及Cκ的5’端序列,其中Vκ-Jκ-IGKC1组合的克隆33个,Vκ-Jκ-IGKC2组合的克隆18个;68个Vκ胚系基因中有22个出现,其中频率最高的是IGKV1S10*01(12次),其次是IGKV1S36*01、IGKV1S37*01和IGKV1S4*01(各5次),其余均为3次以下;8个Jκ胚系基因中只有1个出现,为IGKJ1-2*01;2个Cκ基因的等位基因分别为IGKC1*01和IGKC2*03。33个Vκ-[IGKJ1-2*01]-[IGKC1*01]克隆中有17种不同的组合方式,其中频率最高的为[IGKV1S10*01]-[IGKJ1-2*01]-[IGKC1*01](7次)。18个Vκ-[IGKJ1-2*01]-[IGKC2*03]克隆中有11种不同的组合方式,频率最高的为[IGKV1S10*01]-[IGKJ1-2*01]-[IGKC2*03](5次)。Vκ-Jκ-Cκ组合方式相同的克隆,序列仍具有明显的差异。结论利用自行设计的兼并引物,成功并特异地从兔外周血总RNA中直接扩增出了κ轻链的可变区,且产物具有良好的多样性,但所有Vκ-Jκ-Cκ组合中只出现了1种Jκ基因。

鸡源Bursin-ScFv噬菌体展示文库的构建及初步筛选

本研究利用抗三肽囊素(Bursin)单克隆抗体免疫SPF来航鸡,获得产生抗独特型抗体的脾细胞,从中提取总RNA,经反转录合成cDNA第一链。以cDNA第一链为模板,根据来航鸡IgG抗体重链(VH)、轻链(VL)可变区基因FR设计引物,进行PCR扩增。在体外扩增出该抗体的可变区VH和VL基因(大小分别约为370和320 bp)。通过重叠延伸反应(SOE),以(Gly4Ser)3为连接肽,将VH和VL基因连接成为VH-Linker-VLScFv,将ScFv DNA与噬菌粒载体pHEN1的连接产物转化于大肠杆菌TG1,经辅助噬菌体M13K07感染后,获得重组的鸡源抗三肽囊素独特型抗体全套单链噬菌体抗体库。并测得该库容量约为5×105,噬菌体中ScFv基因的插入率为80%,用辅助噬菌体援救后,得到滴度为1011PFU/mL的初级噬菌体抗体库。用抗Bursin单克隆抗体(2F9-4/HU2)进行4轮"吸附-洗脱-扩增"的淘筛,出现特异性富集。经ELISA、动物试验表明所筛选的5个阳性克隆可与抗Bursin单克隆抗体(2F9-4/HU2)特异性结合,并能促进抗体的生产。

三肽囊素抗独特型ScFv噬菌体展示文库的构建

利用在体外构建的三肽囊素抗独特型抗体可变区VH和VL基因,通过重叠延伸反应(SOE),以(Gly4Ser)3为连接肽,将VH和VL基因连接成为VH-Linker-VLScFv,且ScFvDNA与噬菌粒载体pHEN1的连接产物转化于大肠杆菌TG1,经辅助噬菌体M13K07感染后,获得重组的鸡源抗三肽囊素抗独特型抗体全套单链噬菌体抗体库,并将该抗体库展示在噬菌体表面,以利用噬菌体展示技术的强大筛选能力筛选出与三肽囊素同功能单链抗体(Bursin-ScFv)。

抗人卵巢癌单克隆抗体COC183-B_2轻链可变区基因的体外扩增、克隆及序列分析

目的分离抗人卵巢癌单克隆抗体ＣＯＣ１８３－Ｂ２轻链可变区（ＶＬ）基因并测定其核苷酸序列。方法用ＰＣＲ方法体外扩增单抗ＣＯＣ１８３－Ｂ２ＶＬ基因，将其克隆入ＰＵＣ１９载体，重组子用Ｓａｎｇｅｒ’ｓ双脱氧链终止法测定其核苷酸序列，将其序列通过Ｉｎｔｅｒｎｅｔ与ＧｅｎｅＢａｎｋ、ＥＭＢＬ、ＤＤＢＪ和ＰＤＢ已发表的抗体序列进行比较分析。结果ＶＬ基因全长３３６ｂｐ，属小鼠免疫球蛋白轻链第Ⅱ亚类（ＳｕｂｇｒｏｕｐⅡ），由种系基因的ＶＫ及Ｊ基因的ＭＵＳＪＫ２重排而成。该ＶＬ基因序列已被ＧｅｎｅＢａｎｋ收录（ａｃｅｓｉｏｎＮｏ．ｇｂＡＦ０４４０７７）。结论该ＶＬ基因为抗人卵巢癌单抗ＣＯＣ１８３－Ｂ２功能性轻链可变区基因。

抗癌胚抗原单区抗体的质粒构建及表达

目的对抗癌胚抗原单区抗体进行表达研究。方法采用PCR技术将已获得的抗癌胚抗原（CEA）鼠源单克隆抗体E7B10重、轻链可变区基因（VH、VK）进行改造后分别克隆进大肠杆菌表达质粒pET－24α（＋）中，并进行表达。结果显示重、轻链可变区在大肠杆菌中获得了高效表达，其表达量达到菌体总蛋白的20％与25％，SDS－PAGE和Westernblot图谱显示表达产物分子量为13KD、12KD，与其基因编码蛋白的理论推算值相符。表达产物在胞内主要以不溶性包含体存在。结论经变性和复性处理后，RIA表明重链可变区基因表达产物具有结合其特异性抗原CEA的能力。

抗人血管内皮生长因子(VEGF)单克隆抗体轻链可变区基因的克隆和序列分析

为构建和表达抗人血管内皮生长因子（ＶＥＧＦ）工程抗体奠定基础，从分泌抗人ＶＥＧＦ抗体的杂交瘤细胞株中提取总ＲＮＡ，利用反转录－聚合酶链反应方法，克隆抗人ＶＥＧＦ单克隆抗体轻链可变区基因，将其重组入ｐＥＧＭＲ－ＴＶｅｃｔｏｒ测序载体测序。结果表明轻链可变区序列全长３３３ｂｐ，编码１１１个氨基酸，通过国际联机检索及Ｋａｂａｔ库扫描证实，该轻链可变区符合小鼠免疫球蛋白轻链可变区基因特征，同源性高达８９．３％，归属小鼠轻链可变区基因第Ⅲ亚组。

抗肾综合征出血热病毒血凝素单克隆抗体8F8轻链可变区基因的克隆和序列分析

作者从抗肾综合征出血热病毒血凝素单克隆抗体(单抗)8F8杂交瘤细胞提取RNA,逆转录成cD-NA,应用PCR快速克隆出8F8单抗的轻链可变区基因(V_L)。并对8F8单抗V_L的核苷酸序列和相应编码的氨基酸序列进行了测定和推导。

哲罗鱼免疫球蛋白轻链可变区序列及其多样性

采用RT-PCR技术从哲罗鱼主要免疫器官脾脏总RNA中获得免疫球蛋白(immunoglobulin,Ig)轻链可变区cDNA克隆,随机挑取51个阳性克隆菌落进行测序,得到46条完整的不重复序列,用以确定哲罗鱼IgL的家族种类,为哲罗鱼病毒性疾病的疫苗研制提供理论依据。经过BLUST网络对比,结果显示:其与GenBank报导的虹鳟(序列号为X68517.1和X68519.1)序列的相似性均达90%以上,46条序列的核苷酸相同率分别为最低86.1%(P4与P43)至最高的99.8%(P21与P38)之间不等;经DNAstar5.0软件包MegAling中JotunHein方法对所得序列进行氨基酸同源性比较,得到两个不同的家族;通过可变性参数计算方法可知哲罗鱼IgL的可变性主要集中在CDRs区,可变性最高的区域为CDR3区;对可变区中CDR3序列进行分析后,得出哲罗鱼Ig轻链可变区的重排方式是Jκ基因片段位于Vκ基因片段的3′端的结论,这种重排方式增加了核苷酸不同的连接方式,使哲罗鱼抗体具有更多的可变性空间;对照其亲水性分布图可知:可变区的亲水性氨基酸主要分布于LP前端,FR1末端,完整的FR2,FR3两端,以及CDR1,CDR2和CDR3前端。

用聚合酶链反应制备抗端粒酶蛋白重链和轻链可变区基因

目的：为了制备抗端粒酶蛋白hTERT可变区基因。方法：采用Ni-NTA树脂层析法从PBKTRT转染的 E.coli JM109阳性菌中分离纯化端粒酶蛋白hTERT，并免疫小鼠。从免疫的小鼠脾脏中提取淋巴细胞中总RNA，逆转录成cDNA，以逆转录合成的cDNA第一条链为模板，分别用VH和VL引物，通过PCR进行扩增。结果：PCR扩增反应产生350bp大小的抗hTERT重链和轻链可变区基因。VH和VL基因片段的获得为进一步制备抗hTERT单功能区抗体（dABs）和单链抗体ScFv奠定了实验基础。结论：提示该方法具有稳定性好，易于重复，扩增后VH和VL量较高的优点。

抗BAFF单克隆抗体轻链和重链可变区基因的克隆及鉴定

目的:在本实验室成功制备小鼠抗人BAFF单克隆抗体的基础上,通过分子克隆方法获得该抗体可变区基因序列。方法:从1株小鼠抗人BAFF单克隆抗体杂交瘤细胞FMMUB4中提取总RNA,以此为模版反转录成cDNA,用针对小鼠单克隆抗体重链和轻链可变区基因序列的特异性引物分别进行PCR反应,PCR产物连接入载体,经筛选阳性克隆、酶切鉴定后送测序,测序结果进行生物信息学分析。结果:成功克隆了抗BAFF单克隆抗体FMMUB4重链和轻链可变区基因,测序结果证实序列正确。结论:获得了抗BAFF单克隆抗体FMMUB4重链和轻链可变区基因序列,为下一步构建相关基因工程抗体打下良好基础。

抗bFGF鼠单克隆抗体轻链可变区基因的克隆及序列分析

我们采用基因工程抗体制备技术，从分泌抗人 ｂ Ｆ Ｇ Ｆ单抗的鼠杂交瘤细胞成功地克隆了其轻链可变区基因，并对其进行了序列测定及抗体基因结构分析。这为构建 ｂ Ｆ Ｇ Ｆ单链抗体，防止 ｂ Ｆ Ｇ Ｆ引起的副作用及进行体内定位诊断等研究打下了基础。

抗黄曲霉毒素B1单链抗体基因克隆及其结构分析

【目的】克隆构建黄曲霉毒素B1(AFB1)单链抗体(scFv)基因,并对其编码蛋白序列和结构进行分析预测,为scFv分子修饰改造及在免疫学检测中的应用提供参考依据。【方法】以抗AFB1单克隆抗体杂交瘤细胞株为原料,通过PCR扩增重链可变区(VH)和轻链可变区(VL),以(Gly4Ser)3为柔性接头(Linker)拼接构建抗AFB1 scFv基因,并采用在线生物信息学分析软件对其氨基酸序列、理化性质及蛋白结构进行分析预测。【结果】抗AFB1 scFv基因全长744 bp,编码248个氨基酸,分子量为26312.05 Da,理论等电点(pI)5.70,其二级结构中含有35个α-螺旋(占14.11%)、28个β-折叠(占11.29%)、85个延伸链(占34.28%)和100个随机卷曲(占40.32%),在三级结构中连接肽卷曲将VH和VL区域牵拉而相互靠近,形成典型的抗体结构——沟槽结构,是scFv的抗原结合区域。【结论】构建的抗AFB1 scFv其VH含有117个氨基酸、VL含有116个氨基酸,具备典型抗体结构——沟槽结构,能与抗原特异性结合。

抗肠炎沙门氏菌单链抗体制备及其特异性分析

目的:利用基因工程技术制备抗肠炎沙门氏菌的单链抗体。方法:从抗肠炎沙门氏菌单克隆抗体的杂交瘤细胞中纯化RNA,反转录后扩增出抗体的重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)基因片段,采用重叠延伸的方法,用柔性多肽Linker接头(Gly4Ser)3按VL-Linker-VH方式将VH基因和VL基因拼接成单链抗体基因片段后,连接到pGEX-4T-1载体上,进行重组转化。挑取阳性克隆,经IPTG诱导后,通过GST柱进行亲和层析,最后利用ELISA检测抗体的活性。结果:成功构建了表达抗肠炎沙门氏菌单链抗体的基因工程菌株,经SDS-PAGE和ELISA检测结果表明,诱导表达的单链抗体scFv分子量约为60 kDa,其能特异与肠炎沙门氏菌结合,但与副甲伤寒沙门氏菌、鸭沙门氏菌、鼠伤寒沙门氏菌有轻度交叉反应。结论:成功构建了抗肠炎沙门氏菌单链抗体的表达菌株,表达的单链抗体scFv可作为沙门氏菌的检测的候选抗体分子。

5’-RACE法扩增抗人乳头瘤病毒16型L1蛋白单克隆抗体轻链可变区基因及序列分析

目的获得抗人乳头瘤病毒16型（HPV16）L1蛋白单克隆抗体的轻链可变区（VL）基因并分析序列。方法从分泌抗HPVl6L1蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞中提取总RNA，逆转录形成CD-NA，用5’-RACE策略扩增抗体轻链可变区基因，经琼脂糖凝胶电泳鉴定，并测序及进行序列分析。结果VL基因全长336bp，编码112个氨基酸，基因测序结果符合小鼠抗体轻链可变区特征。结论5’-RACE法成功获得了抗HPV16L1蛋白的单克隆抗体轻链可变区基因的真实序列，为基因工程抗体研究奠定了良好基础。

抗心肌肌凝蛋白重链的单链抗体V_H和V_L基因的合成

目的为研制心肌显像剂—抗人心肌肌凝蛋白重链(HCMHC)的单链抗体,合成抗HCMHC单链抗体的VH和VL基因。方法用TRIZOL试剂从抗HCMHC McAb杂交瘤细胞提取总RNA,合成第一链cDNA,以这第一链cDNA为模板,用合成的特异引物、DNA聚合酶和四种单核苷酸,对重链可变区(VH)基因和轻链可变区(VL)基因进行PCR扩增。对各步骤的产物进行鉴定,并做了对RNA的稳定性与贮存温度的关系,MgCl2浓度和循环温度的最优化的选择。结果合成的第一链cDNA纯度达95%;扩增产物的琼脂糖凝胶电泳带呈单一明亮泳带,VH和VL基因分子量分别为340bp和320bp,与文献相一致。结论成功合成了VH和VL基因,为心肌显像及其显像剂抗HCMHC单链可变区抗体的研究打下了基础。