Vasorin在非小细胞肺癌中的表达及与临床特征的关系

目的探讨Vasorin在非小细胞肺癌(NSCLC)中的表达及临床意义。方法收集2020年1—10月川北医学院附属医院收治的40例NSCLC患者的癌组织及癌旁组织标本,应用免疫组织化学染色对所有标本进行Vasorin和CD34检测,分析Vasorin与NSCLC血管生成[微血管密度(MVD)]之间的关系及临床意义。结果NSCLC组织Vasorin的表达评分和MVD明显高于癌旁组织,差异均有统计学意义(P<0.05)。不同肿瘤最大径、TNM分期患者Vasorin表达评分比较,差异均有统计学意义(P<0.05)。不同肿瘤最大径、TNM分期、淋巴结转移情况患者MVD比较,差异均有统计学意义(P<0.05),但二者在NSCLC中的表达无相关性(r s=0.246,P>0.05)。结论Vasorin在NSCLC中过表达,与肿瘤最大径、TNM分期关系密切,可能是判断NSCLC分期、预测预后的重要参考指标。但Vasorin与NSCLC血管生成无明显相关性,尚不能作为评估NSCLC血管生成的重要指标。

Vasorin蛋白的研究进展

目的Vasorin(VASN)蛋白是一种参与了体内血管修复的跨膜糖蛋白,在肿瘤的发生及发展过程中起着重要的作用。方法基于国内外对VASN的研究成果,现针对VASN分子结构和蛋白表达进行分析。结果综述了VASN的生理学功能,讨论了其在肾病、肝癌、胶质瘤、肺癌、甲状腺癌以及乳腺癌中的作用,且分析了VASN的临床应用及其发展。结论为相关工作者的研究提供参考。

应用高效电融合技术制备小鼠抗人vasorin(VASN)单克隆抗体

目的通过电融合法制备肝癌候选标志物人vasorin(VASN)蛋白单克隆抗体并进行鉴定。方法以人带组氨酸标签的VASN重组蛋白(VASN-His)免疫小鼠后进行细胞电融合,间接ELISA筛选能够结合天然VASN的阳性克隆。通过ELISA检测抗体的效价及亲和力、Western blot法检测抗体能否识别HepG2细胞中VASN蛋白。结果在脾细胞与Sp2/0细胞的比例为2∶1,交变电场场强50 V 2 MHz 20 s,直流脉冲强度500 V 0.5 s时,融合率达0.31%。获得2株小鼠抗人VASN单克隆抗体(4H1和8B9),抗体最高效价为1∶256000,亲和力最高可达到4.9×10^(6)L/mol;2株抗体均可识别HepG2细胞的VASN蛋白。结论运用细胞电融合法成功制备2株小鼠抗人VASN的单克隆抗体。

抗VASN-EGFFN3重组蛋白的单克隆抗体的制备

目的:通过大肠杆菌表达系统表达和纯化VASN-EGFFNN3重组蛋白,免疫小鼠制备抗VASN-EGFFN3单克隆抗体。方法:构建p ET30a(+)-VASN-EGFFNN3重组载体,以大肠杆菌BL21(DE3)为载体表达VASN-EGFFNN3重组蛋白。用镍离子亲和层析柱纯化VASN-EGFFNN3重组蛋白。利用纯化后的VASN-EGFFN3重组蛋白免疫BALB/c小鼠后,用杂交瘤技术制备抗VASN-EGFFN3单克隆抗体。结果:成功构建pET30a(+)-VASN-EGFFNN3重组原核表达质粒,诱导的重组VASN-EGFFNN3蛋白主要以包涵体的形式存在。纯化蛋白免疫BALB/c小鼠后获得的血清抗体效价大于1∶2187000,免疫效果良好。利用杂交瘤技术获得2株杂交瘤细胞株。结论:成功利用大肠杆菌表达系统制备并纯化VASN-EGFFNN3重组蛋白,通过杂交瘤技术成功制备小鼠抗VASN-EGFFN3单抗。

VASN核酸适配体与端粒酶逆转录酶脱氧核酶偶联物的生物学功能研究

目的研究肝癌细胞特异性膜蛋白VASN(vasorin)的核酸适配体V4-2与靶向端粒酶逆转录酶(human telomerase reverse transcriptase,hTERT)的脱氧核酶(DNAzyme,Dz)偶联形成的偶联物V4-2-Dz在体外和肝癌细胞内的靶RNA切割活性,为脱氧核酶递送提供新策略。方法Mfold网站预测V4-2-Dz的二级结构,通过体外切割实验检测V4-2-Dz的切割活性,通过流式细胞术和激光共聚焦实验检测V4-2-Dz和肝癌细胞HepG2结合的能力,利用RT-qPCR和MTT法分析V4-2-Dz作用于HepG2细胞对h TERT mRNA表达水平和细胞增殖的影响。结果体外切割实验表明,V4-2-Dz具有切割hTERT RNA活性;流式细胞术和激光共聚焦实验结果显示,V4-2-Dz可以特异结合并进入HepG2细胞,V4-2-Dz可显著降低HepG2细胞中hTERT mRNA水平并抑制细胞增殖。结论VASN蛋白的核酸适配体与端粒酶逆转录酶的脱氧核酶偶联物V4-2-Dz具有靶向肝癌细胞递送和切割活性,基于适配体和脱氧核酶的偶联物为肿瘤药物研究提供新的思路。

CRISPR/Cas9联合Cre-Loxp系统建立VASN条件敲除的小鼠肝细胞系

目的:利用CRISPR/Cas9技术联合Cre-Loxp系统的条件性敲除策略构建VASN基因敲除的AML12小鼠肝细胞株。方法:在VASN基因第二外显子上下游设计靶点并合成gRNA序列,构建2个CRISPR/Cas9重组载体;设计构建VASN上下游分别带有Loxp序列和旁侧同源序列的供体载体donor DNA质粒;将3个质粒共转染至小鼠肝细胞AML12中,分离单克隆,提取基因组DNA,经PCR及测序鉴定获得稳定敲入Loxp序列的单克隆细胞株AML12-Loxp;将pALB-Cre质粒转染至AML12-Loxp,筛选建立敲除VASN基因的细胞系。结果:成功构建2个靶向敲除VASN基因的pX459-gRNA-VASN-1和pX459-gRNAVASN-2重组载体及一个供体载体;转染药筛后获得12个单细胞克隆,经测序,5个单克隆细胞实现VASN基因上下游精确敲入Loxp序列;同源重组敲入效率为41.6%;pALB-Cre质粒转染后获得20个单细胞克隆,经PCR和测序获得12个VASN基因敲除的单克隆细胞,敲除效率为60%。结论:利用CRISPR/Cas9技术联合Cre-Loxp系统成功构建了VASN基因敲除的AML12细胞,为后续体外研究VASN在肝细胞中的功能及在动物体内实现VASN的条件性敲除奠定了分子基础。

人vasorin蛋白的基因克隆、表达及纯化

目的:克隆、表达人vasorin(VASN)蛋白。方法:利用PCR方法从HepG2细胞的cDNA中扩增获得目的基因,并插入带有6×His标签的原核高效可溶性表达载体pET28a中,构建重组表达质粒pET28a-VASN,将重组表达质粒转化大肠杆菌BL21(DE3),经IPTG诱导后目的基因获得表达,对融合目的蛋白进行Ni2+金属螯合柱纯化。结果:内切酶鉴定及基因序列测定证实重组表达质粒构建成功;对目的蛋白进行了原核表达,SDS-PAGE显示相对分子质量为61×103的特异表达条带;Western印迹证实目的蛋白为VASN,且主要以包涵体形式存在;对经尿素变性的表达产物进行了亲和层析纯化,有利于以后的变性、复性过程。结论:获得了人VASN融合蛋白,为其进一步的生物学功能研究奠定了基础。

人vasorin蛋白胞外结构域单克隆抗体的纯化及应用

目的:纯化人vasorin(VASN)蛋白胞外结构域的单克隆抗体并鉴定。方法:用表达人VASN蛋白胞外结构域单克隆抗体的杂交瘤细胞免疫小鼠,收集腹水,纯化抗体;ELISA检测单抗的特异性和亲和力,Western印迹、免疫共沉淀、细胞免疫荧光等实验检测单抗的特异性与可能的用途。结果:纯化获得2株抗VASN胞外结构域单抗V20和V21,ELISA结果显示二者均特异性强、亲和力高;Western印迹显示2株单抗均可结合Hep G2细胞中的VASN蛋白,以V20为佳;免疫共沉淀实验结果显示V21能够钓取Hep G2细胞中的VASN蛋白及细胞培养上清中的分泌型VASN;免疫荧光实验结果显示V21能与Hep G2细胞的VASN蛋白结合。结论:纯化获得2株抗人VASN胞外结构域单抗,为进一步研究VASN蛋白的生物学功能提供了实验工具。

Vasorin蛋白特异单链DNA适配体的筛选与鉴定

目的:筛选能特异识别vasorin(VASN)蛋白的单链DNA(ss DNA)适配体并对其进行鉴定。方法:利用SPRSELEX技术筛选VASN蛋白特异ss DNA适配体,通过基因克隆测序、MEME在线软件和RNA structure软件分析富集文库序列并挑选出候选适配体序列,利用EMSA、ELISA、流式细胞术对候选适配体进行特异性与亲和力鉴定。结果:经过5轮SELEX筛选,获得了与VASN蛋白特异结合的ss DNA适配体富集文库,合成候选适配体,经EMSA和ELISA检测分析,证实适配体V4-2能与VASN蛋白特异结合,而不与无关对照牛血清白蛋白结合,其平衡解离常数为281.3±103.7 nmol/L;流式细胞术证实V4-2能够特异识别高表达VASN蛋白的Hep G2细胞。结论:筛选获得特异识别VASN蛋白的ss DNA适配体V4-2。

Vasorin基因稳定敲除HepG2细胞株的建立及其生物学功能研究

目的:利用CRISPR/Cas9技术建立人Vasorin(VASN)基因稳定敲除的HepG2细胞株,并研究VASN蛋白对细胞增殖和迁移等生物学功能的影响。方法:根据人VASN序列设计向导RNA,将其克隆至表达载体pCas-Guide,获得质粒pCas-gRNA;PCR扩增VASN编码基因左、右同源臂及潮霉素B抗性基因,通过重叠PCR将三者拼接为一条片段,并克隆至载体pBackZero-T,获得质粒pBackZero-T-VASN;上述2种重组质粒共转染HepG2细胞,经潮霉素B筛选,通过基因组PCR、RT-q PCR和Western印迹实验检测VASN基因是否被敲除。利用CCK-8法和Transwell法检测VASN稳定敲除细胞株的增殖和迁移能力。结果:向导RNA表达质粒pCas-gRNA和DNA供体质粒pBackZero-T-VASN构建成功;基因组PCR结果显示,潮霉素B基因正确重组至VASN基因中;RT-PCR显示VASN m RNA水平显著降低,Western免疫印迹结果显示VASN蛋白表达水平显著降低;VASN稳定敲除细胞株的增殖和迁移能力比野生型细胞明显减弱。结论:构建了pCas-gRNA和pBackZero-T-VASN质粒,获得了VASN缺失的细胞株,验证了VASN蛋白参与细胞的增殖和迁移过程,为深度探讨VASN的生物学功能及其分子机制奠定了基础。

乙醇对HepG2细胞VASN蛋白表达与分泌水平的影响研究

目的观察乙醇刺激下HepG2细胞VASORIN蛋白(VASN)的变化,分析乙醇对HepG2细胞VASN蛋白表达与分泌水平的影响。方法使用不同浓度乙醇处理液对HepG2细胞进行刺激,分别在24、48、72 h收集细胞,应用荧光定量核酸扩增检测系统(qPCR)检测HepG2细胞VASN信使核糖核酸(mRNA)水平,取超滤浓缩后的样品进行分泌水平检测,分析乙醇对HepG2细胞VASN蛋白表达与分泌水平的影响。结果与无乙醇刺激比较,25 mmol/L浓度乙醇刺激、50 mmol/L浓度乙醇刺激、100 mmol/L浓度乙醇刺激在24、48、72 h下HepG2细胞VASNmRNA水平均明显较高;与无乙醇刺激比较,25 mmol/L浓度乙醇刺激、50 mmol/L浓度乙醇刺激、100 mmol/L浓度乙醇刺激在24、48、72 h下HepG2细胞VASN蛋白分泌水平均明显较高。结论乙醇能促进HepG2细胞VASN蛋白表达与分泌水平的提高,可为生物学细胞研究等提供有效参考。

VASN基因敲除小鼠的基因型的鉴定方法研究

目的:确定提高VASN基因敲除小鼠基因型检出率的方法。方法:根据VASN基因外显子设计2对gRNA,将Cas9和gRNA共注射入受精卵生产出F0代小鼠,将F0代小鼠进行近交繁殖产生F1代,分别用3种方法鉴定F1代小鼠基因型,比较3种方法的检出率。方法一:DNA提取试剂盒A+DNA高保真聚合酶a+PCR扩增条件1,鉴定16只小鼠;方法二:DNA提取试剂盒A+DNA高保真聚合酶b+PCR扩增条件2,鉴定14只小鼠;方法三:DNA提取试剂盒B+DNA高保真聚合酶b+PCR扩增条件3,鉴定9只小鼠。结果:Cas9和gRNA共注射入319枚受精卵,分5批移植,其中3批受孕成功,胚胎移植率为60.00%,共获得16只F0代小鼠,经过自交繁殖共获得39只F1代小鼠。分3批分别采用3种方法进行鉴定,方法一的基因型检出率为12.50%;方法二的基因型检出率为64.29%;方法三的基因型检出率为100.00%,且与测序结果吻合,电泳图无杂带。结论:DNA提取试剂盒B+DNA高保真聚合酶b+PCR扩增条件3的基因型鉴定检出率最高。

乙醇刺激HepG2细胞分泌VASN蛋白的生物学功能研究

目的：探究乙醇对HepG2细胞VASN蛋白表达与分泌水平的影响，及其对HUVEC细胞迁移的影响。方法乙醇刺激HepG2细胞，定量PCR （ qPCR）检测HepG2细胞VASN mRNA水平的变化， Western印迹检测HepG2细胞与细胞上清中VASN蛋白水平的变化。划痕愈合实验检测细胞共培养条件下，乙醇刺激的HepG2细胞培养上清对HUVEC细胞迁移的影响。结果 qPCR结果显示，乙醇可上调HepG2细胞VASN mRNA水平。 Western印迹结果显示，细胞VASN蛋白表达与分泌水平升高。划痕愈合实验结果表明乙醇刺激HepG2细胞VASN蛋白的分泌增加，可以促进HUVEC细胞的迁移。结论乙醇刺激导致HepG2细胞VASN蛋白表达水平和分泌水平升高，并可促进与其共培养的HUVEC细胞迁移。