溶藻弧菌VcrV基因缺失株的构建及生物学特性

为研究溶藻弧菌Ⅲ型分泌系统VcrV基因的功能和生物学特性,采用同源重组技术成功构建了溶藻弧菌缺失株ΔVcrV,并用PCR检测其遗传稳定性。结果显示,缺失株遗传稳定;与野生株相比,生长和自凝集能力无显著变化;但生物膜形成能力降低,半致死剂量升高16.5倍;游动性和涌动性极显著升高,细胞粘附能力极显著降低(P<0.01),对H_(2)O_(2)和NaCl的耐受性降低;对头孢呋辛、麦迪霉素、克林霉素抗生素敏感度上升,对丁胺卡那、多粘菌素B抗生素敏感度降低;活性氧含量极显著降低(P<0.01),脯氨酸、肽聚糖、β-内酰胺酶、过氧化氢酶、超氧化物歧化酶、谷胱甘肽过氧化物酶指标均极显著升高(P<0.01)。缺失株生物学特性表明,VcrV基因参与溶藻弧菌Ⅲ型分泌系统性的致病性和多种生物学功能。

vcrV基因对副溶血弧菌生物学特性及Ⅲ型分泌系统1效应蛋白易位的影响

【背景】副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)具有两套Ⅲ型分泌系统(type Ⅲ secretion system,T3SS)。T3SS1通过向宿主细胞分泌效应蛋白发挥致病作用,vcrV基因位于T3SS1编码基因簇。【目的】以vcrV基因为研究对象,探索其对副溶血弧菌生物学特性及T3SS1致病机制的影响。【方法】以副溶血弧菌POR-1株为参考菌株,利用同源重组技术构建vcrV基因缺失株ΔvcrV和回补株CΔvcrV,比较各菌株在生长性能、生物被膜形成能力、细胞黏附及细胞毒性等生物学特性的差异,应用Western Blot检测T3SS1诱导条件下POR-1、ΔvcrV和CΔvcrV等菌株效应蛋白分泌量,进一步利用具有过表达载体pMMB207-vp1683-CyaA的各菌株侵染HeLa细胞,通过Western Blot检测细胞内效应蛋白VopR(Vp1683)的易位量。【结果】与基础菌株POR-1相比,缺失vcrV基因不影响副溶血弧菌的生长性能、生物被膜形成能力及细胞黏附等生物学特性,显著降低了对HeLa细胞的毒性作用,具有过表达载体的POR-1、ΔvcrV和CΔvcrV等菌株效应蛋白VopR的分泌差异不显著,ΔvcrV菌株侵染HeLa细胞的过程中,VopR的易位量显著下降。【结论】vcrV基因参与T3SS1介导的细胞毒性过程,对于副溶血弧菌T3SS1效应蛋白易位是必需的,具有过表达载体的ΔvcrV仍能分泌效应蛋白VopR。

鼠疫耶尔森氏菌LcrV基因在大肠杆菌中的高效表达

将测序后的鼠疫耶尔森氏菌 (Yersiniapestis)LcrV基因重组质粒pGEM T ypV酶切 ,克隆于原核表达载体pBV2 2 0 ,构建成pBV ypV表达质粒 ,转化大肠杆菌DH5α ,进行PCR及酶切鉴定 ,筛选阳性克隆 ,进行温控诱导表达 ,SDS PAGE检测表达产物 ,在相对分子质量 3 80 0 0处有一表达条带 ,经薄层扫描分析目的蛋白条带占全菌蛋白的3 8.4 %以上 ,主要以可溶形式存在。