梅花鹿鹿茸I型胶原诱导骨髓基质干细胞成骨分化及其分子机制的研究

目的 探讨梅花鹿鹿茸Ⅰ型胶原诱导骨髓基质干细胞向成骨细胞分化及其分子机制.方法 采用CCK-8法选择诱导分化和促成骨的最佳浓度;采用分光光度法检测ALP活性,并用改良Gomori法进行ALP染色,采用茜素红法进行钙化结节染色.采用RT-PCR法检测成骨分化的关键因子RunX2 mRNA的表达,成骨标志物ALP mRNA的表达,并进行半定量分析.结果 2.5g·L-1的鹿茸Ⅰ型胶原促进BMSCs的增殖使ALP活性降低,5～40 g·L-1的鹿茸Ⅰ型胶原抑制BMSCs的增殖,呈时间、剂量依赖性,5g·L-1的鹿茸Ⅰ型胶原使ALP活性增加显著且促进钙化结节的形成.RT-PCR检测5g·L-1的鹿茸Ⅰ型胶原上调RunX2、ALP基因的表达,而2.5g·L-1的鹿茸Ⅰ型胶原则下调RunX2、ALP基因的表达.结论 梅花鹿鹿茸Ⅰ型胶原可以通过上调RunX2基因的表达诱导BMSCs向OB分化,且与浓度密切相关.

鹿茸胶原多肽复合酶水解工艺研究

【目的】对鹿茸胶原多肽进行复合酶水解,优化水解工艺,并测定水解液分子量分布。【方法】以碱性蛋白酶和胰蛋白酶为供试酶类,选用酶解时间、pH值、酶解温度、加酶量为影响因素,采用响应面试验设计优化单酶水解条件,根据响应面试验所得到的单酶水解的最适条件,确定双酶复合水解方案。通过Sephadex G25测定鹿茸胶原多肽的分子量分布。【结果】碱性蛋白酶最优水解条件为：酶解时间3.6h,pH值10.50,酶解温度55℃,加酶量4%,水解液的水解度为22.03%;胰蛋白酶最优水解条件为：酶解时间3.2h,pH值8.00,酶解温度50℃,加酶量4.4%,水解液的水解度为15.81%。复合酶水解条件：酶解温度为52.5℃,调节pH值为10.50,加入4%的碱性蛋白酶酶解3.6h;调节pH值至8.00,加入4.4%的胰蛋白酶酶解3.2h,所得水解液的水解度可达33.42%。复合酶水解胶原多肽的分子量分布在400~1 400u。【结论】确定了鹿茸胶原多肽碱性蛋白酶和胰蛋白酶复合水解的工艺条件。

鹿茸Ⅰ型胶原对骨髓间充质干细胞增殖的影响及其与Ⅱ型胶原和聚集蛋白聚糖表达的关系

目的:观察鹿茸Ⅰ型胶原(VACTⅠ)对骨髓间充质干细胞(BMSCs)增殖及细胞周期的影响,探讨其与Ⅱ型胶原和聚集蛋白聚糖表达的关系。方法:选取健康雄性4周龄SD大鼠,差时贴壁法提取BMSCs并传代培养。实验分为空白对照组、转化生长因子β3(TGF-β3)(10μg·L^-1)组和不同浓度(1.25、2.50、5.00、10.00和20.00 g·L^-1)VACTⅠ组,CCK-8法检测各组BMSCs增殖率,ELISA法检测各组细胞上清液中骨形态生成蛋白4(BMP-4)和转录因子Sox9水平,流式细胞术检测各组不同细胞周期BMSCs百分率,RT-PCR法和Western blotting法分别检测各组细胞中Ⅱ型胶原和聚集蛋白聚糖mRNA和蛋白表达水平。结果:与空白对照组比较,2.50~20.00 g·L^-1 VACTⅠ组大鼠BMSCs增殖率明显降低(P<0.05或P<0.01);ELISA法,与空白对照组比较,TGF-β3组和不同浓度VACTⅠ组细胞上清液中BMP-4和Sox9水平明显升高(P<0.05或P<0.01);流式细胞术,与空白对照组比较,TGF-β3组和不同浓度VACTⅠ组不同细胞周期BMSCs百分率差异无统计学意义(P>0.05);RT-PCR法,与空白对照组比较,TGF-β3组和不同浓度VACTⅠ组细胞中Ⅱ型胶原和聚集蛋白聚糖mRNA表达水平明显升高(P<0.05);Western blotting法,与空白对照组比较,TGF-β3组和不同浓度VACTⅠ组细胞Ⅱ型胶原和聚集蛋白聚糖蛋白表达水平明显升高(P<0.05或P<0.01)。结论:VACTⅠ可促进BMSCs释放BMP-4和Sox9,提高Ⅱ型胶原和聚集蛋白聚糖表达水平,抑制BMSCs增殖,是一种潜在的成软骨分化诱导剂。

鹿茸中多种水溶性成分的综合提取工艺的研究

为了建立鹿茸中3个水溶性成分的综合提取工艺,获得高纯度的鹿茸蛋白、鹿茸多糖及鹿茸胶原蛋白,以充分利用鹿茸资源,扩展鹿茸的应用范围。依次采用低浓度乙醇回流法、煎煮法和复合酶解法,自鹿茸中提取鹿茸蛋白、多糖及胶原蛋白,其中对蛋白提取溶剂浓度、提取时间和料液比进行了单因素优化,对多糖提取方法、提取时间和料液比进行了单因素优化,以各组分提取质量为指标,计算得率和提取率;以Bradford法、苯酚-硫酸法、羟脯氨酸法分别测定蛋白、多糖和胶原蛋白的含量;明确了鹿茸中多种水溶性成分综合提取工艺参数;并以不同种类鹿茸的多种水溶性成分的综合提取进行提取工艺的验证。结果显示,鹿茸中水溶性成分的最佳综合提取工艺为:鹿茸粉经乙醚及95%乙醇脱之后,以35%乙醇为溶剂,回流提取2 h,获得鹿茸蛋白;残渣煎煮3次,1 h/次,获得鹿茸多糖;残渣加入0.5 mol/L醋酸溶液和4%胃蛋白酶于37℃下提取6 h得鹿茸胶原蛋白。采用此系统工艺提取法,花二杠茸、花鹿三岔茸、马鹿二杠茸和马鹿三岔茸中蛋白提取率分别为20.100%、18.379%、17.285%和14.130%,含量达88.250%以上;多糖提取率分别为4.760%、4.588%、4.255%和3.981%,含量达89.450%以上;胶原蛋白提取率分别为3.983%、3.728%、3.522%和2.836%,含量达88.600%以上。表明采用本提取工艺可顺序提取鹿茸中多种水溶性物质,获得高纯度的鹿茸蛋白、多糖及胶原蛋白;相同鹿源鹿茸的二杠茸水溶性成分含量高于三岔茸水溶性成分含量;花鹿茸水溶性成分含量高于马鹿茸水溶性成分含量。此工艺简单,安全易行,提取率稳定,适于推广。

双酶法制备梅花鹿鹿茸胶原多肽的工艺研究

目的:研究双酶水解鹿茸胶原蛋白制备鹿茸胶原多肽。方法:以梅花鹿鹿茸为原料,采用热水提取鹿茸胶原蛋白,先后加入2种酶酶解,测定酶解后鹿茸胶原多肽相对分子质量分布,根据单因素试验和正交试验确定两种酶的用量和酶解时间。结果:鹿茸胶原多肽的最佳工艺条件为:胃蛋白酶与鹿茸比(g:g)为1:100,酶解12 h,胰蛋白酶与鹿茸比(g:g)为1:100,酶解1 h,酶解得到的鹿茸胶原多肽相对分子质量小于3000约占60.65%,相对分子质量小于5000的约占88.16%,提取率为11.16%,蛋白质含量为89.07%。结论:采用双酶法提取制备鹿茸胶原多肽,相对分子质量小,易被人体消化吸收,该研究为鹿茸胶原多肽产品的开发和应用奠定了基础。

不同形态梅花鹿鹿茸的化学成分对比研究

目的研究不同形态梅花鹿鹿茸化学成分的差异。方法采用紫外分光光度计、杜马斯定氮仪、全自动氨基酸分析仪、超高效液相色谱仪、高效液相色谱仪、气相色谱仪、电感耦合等离子质谱仪、原子荧光光度计等测定并比较了梅花鹿毛桃茸、二杠茸、三岔茸中多糖、粗蛋白、氨基酸、胶原蛋白、脂肪酸、矿质元素、生物胺、核苷、硫酸软骨素9类化学成分的含量差异,用主成分分析(PCA)法综合评价不同形态梅花鹿鹿茸的质量。结果多糖、粗蛋白、氨基酸、胶原蛋白、脂肪酸、矿质元素、生物胺、核苷、硫酸软骨素在毛桃茸中质量分数分别为8.40 mg/g、44.82%、42.24%、23.23%、6234.69 mg/kg、145.69 mg/g、55.12 mg/kg、2271.87 mg/kg、0.74 mg/g;在二杠茸中质量分数分别为8.14 mg/g、52.12%、48.57%、21.50%、8684.27 mg/kg、126.40 mg/g、76.14 mg/kg、3438.37 mg/kg、1.94 mg/g;在三岔茸中质量分数分别为8.64 mg/g、51.86%、45.49%、22.31%、9100.78 mg/kg、138.36 mg/g、70.75 mg/kg、2507.82 mg/kg、1.84 mg/g。结论不同形态梅花鹿鹿茸的化学成分有差异,PCA结果显示,二杠茸质量最好,三岔茸次之,毛桃茸质量最差。该研究为不同形态鹿茸质量评价及分等、分级标准提供参考。

鹿茸液对慢性心力衰竭大鼠心肌细胞凋亡和Ⅰ、Ⅲ型胶原表达的实验研究

目的研究鹿茸液对慢性心力衰竭（cHF）大鼠心肌细胞凋亡和Ⅰ、Ⅲ型胶原表达的影响，探讨鹿茸液治疗CHF的作用和机制。方法本实验采用SD大鼠冠状动脉结扎法制备心梗后CHF动物模型，随机分为鹿茸液高、中、低剂量组、卡托普利组、模型组和空白组，给予相应的药物干预，4周后观察心肌细胞凋亡，心间质Ⅰ、Ⅲ型胶原的变化情况。结果鹿茸液各剂量组和卡托普利组CHF大鼠心肌细胞凋亡及Ⅰ、Ⅲ型胶原表达与模型组相比较低，二者具有统计学差异（P〈0．05），鹿茸液中剂量组和卡托普利组之间无统计学差异（P〉0．05），均优于鹿茸液高剂量组和低剂量组（P〈0．05），鹿茸液高剂量组优于低剂量组（P〈0．05）。结论鹿茸液能够减少CHF大鼠心肌细胞凋亡，减少Ⅰ、Ⅲ型胶原沉淀，从而抑制左室重构，具有良好的应用前景。