鹿茸多肽对骨质疏松模型大鼠的改善作用及对SIRT1/FOXO1信号通路的影响

目的:探讨鹿茸多肽(VAP)对骨质疏松(OP)模型大鼠的保护作用,并阐明其可能的作用机制。方法:60只12周龄SD大鼠随机分为对照组、模型组、阳性药组(1 mg·kg^(-1)·d^(-1)阿仑膦酸钠灌胃)、低剂量(100 mg·kg^(-1)·d^(-1))VAP组、中剂量(200 mg·kg^(-1)·d^(-1))VAP组和高剂量(300 mg·kg^(-1)·d^(-1))VAP组,每组10只。除对照组外,其余各组大鼠肌肉注射地塞米松(2 mg·kg^(-1))复制OP大鼠模型,对照组大鼠肌肉注射等体积生理盐水,每周2次,连续11周。双能X射线骨密度仪检测各组大鼠股骨骨密度(BMD),酶联免疫吸附试验(ELISA)法检测各组大鼠血清中血钙(Ca^(2+))、血磷(P)、骨保护素(OPG)、碱性磷酸酶(ALP)和骨钙素(OCN)水平,生化法检测各组大鼠血清中丙二醛(MDA)水平和超氧化物歧化酶(SOD)活性,HE染色观察各组大鼠骨组织病理形态表现,Western blotting法检测各组大鼠骨组织中沉默信息调节因子1(SIRT1)、过氧化氢酶(CAT)、Runt相关转录因子2(RUNX2)和叉头框蛋白O1(FOXO1)蛋白表达水平。结果:与对照组比较,模型组大鼠股骨BMD明显降低(P<0.05);与模型组比较,阳性药组、中剂量VAP组和高剂量VAP组大鼠股骨BMD明显升高(P<0.05或P<0.01)。与对照组比较,模型组大鼠血清中Ca^(2+)、P和OPG水平及SOD活性明显降低(P<0.05),ALP、OCN和MDA水平明显升高(P<0.05);与模型组比较,低剂量VAP大鼠血清中OPG水平明显升高(P<0.05),阳性药组、中剂量VAP组和高剂量VAP组大鼠血清中Ca^(2+)、P和OPG水平及SOD活性明显升高(P<0.05或P<0.01),阳性药组和各剂量VAP组大鼠血清中ALP、OCN和MDA水平明显降低(P<0.05或P<0.01)。HE染色,与对照组比较,模型组大鼠骨组织中骨细胞数量减少且排列混乱,骨小梁纤细,出现大片断裂,髓腔扩大;与模型组比较,阳性药组、中剂量VAP组和高剂量VAP组大鼠骨组织中骨小梁粗壮,排列紧密。Western blotting法,与对照组比较,模型组大鼠骨组织中SIRT1、CAT、RUNX2和FOXO1蛋白表达水平明显降低(P<0.05);与模型组比较,阳性药组、中剂量VAP组和高剂量VAP组大鼠骨组织中SIRT1、CAT、RUNX2和FOXO1蛋白表达水平明显升高(P<0.05或P<0.01)。结论:VAP对OP模型大鼠具有保护作用,其作用机制可能与介导SIRT1/FOXO1信号通路抗氧化应激作用有关。

鹿茸多肽对大鼠绝经后骨质疏松的改善作用及其机制

目的:探讨鹿茸多肽(VAP)对绝经后骨质疏松症(PMOP)模型大鼠的保护作用,并阐明其可能的作用机制。方法:60只12周龄SD雌性大鼠随机分为假手术组、模型组、阿仑膦酸钠组(1 mg·kg^(-1)·d^(-1)阿仑膦酸钠灌胃)、低剂量VAP组(100 mg·kg^(-1)·d^(-1) VAP灌胃)、中剂量VAP组(200 mg·kg^(-1)·d^(-1) VAP灌胃)和高剂量VAP组(300 mg·kg^(-1)·d^(-1) VAP灌胃),每组10只。除假手术组外,其余各组大鼠摘除双侧卵巢,复制PMOP大鼠模型。双能X射线骨密度仪检测各组大鼠股骨骨密度(BMD),酶联免疫吸附试验(ELISA)法检测各组大鼠血清中血钙(Ca^(2+))、血磷(P)、骨碱性磷酸酶(BALP)和Ⅰ型前胶原N端前肽(PINP)水平,采用相关试剂盒检测各组大鼠血清中超氧化物歧化酶(SOD)活性和丙二醛(MDA)水平,HE染色法观察各组大鼠骨组织病理形态表现,Western blotting法检测各组大鼠骨组织中磷脂酰肌醇-3激酶(PI3K)、磷酸化PI3K(p-PI3K)、蛋白激酶B(AKT)和磷酸化AKT(p-AKT)蛋白表达水平。结果:与假手术组比较,模型组大鼠股骨BMD降低(P<0.01);与模型组比较,阿仑膦酸钠组、中剂量VAP组和高剂量VAP组大鼠股骨BMD升高(P<0.05或P<0.01)。与假手术组比较,模型组大鼠血清中Ca^(2+)、P、BALP及PINP水平和SOD活性降低(P<0.05或P<0.01),MDA水平升高(P<0.01);与模型组比较,中剂量VAP组大鼠血清中P水平升高(P<0.01),阿仑膦酸钠组和高剂量VAP组大鼠血清中Ca^(2+)、P、BALP及PINP水平和SOD活性升高(P<0.05或P<0.01),MDA水平降低(P<0.05)。HE染色,与假手术组比较,模型组大鼠骨组织中骨小梁纤细,大片断裂,髓腔扩大;与模型组比较,阿仑膦酸钠组、中剂量VAP组和高剂量VAP组大鼠骨组织中骨小梁粗壮,排列紧密,骨细胞数量多。Western blotting法,与假手术组比较,模型组大鼠骨组织中p-PI3K/PI3K和p-AKT/AKT比值降低(P<0.01);与模型组比较,各剂量VAP组大鼠骨组织中p-PI3K/PI3K比值升高(P<0.05或P<0.01),阿仑膦酸钠组和高剂量VAP组大鼠骨组织中p-AKT/AKT比值升高(P<0.01)。结论:VAP对大鼠PMOP具有改善作用,其机制可能与VAP调控骨组织中PI3K/AKT信号通路及降低骨组织氧化应激有关。

梅花鹿鹿茸总蛋白对糖尿病肾病大鼠肾损伤的治疗作用及分子机制

目的探讨梅花鹿鹿茸总蛋白提取物(SVPr)对糖尿病肾病(DN)大鼠肾损伤的治疗作用及分子机制。方法将120只Sprague Dawley大鼠按照简单随机数字表法分为对照组、模型组、二甲双胍组、低剂量SVPr组、中剂量SVPr组、高剂量SVPr组,每组20只。模型组、二甲双胍组、低剂量SVPr组、中剂量SVPr组、高剂量SVPr组大鼠造模前禁食12 h,单次腹腔注射链脲佐菌素50 mg•kg^(-1)制备DN大鼠模型;造模成功后,二甲双胍组大鼠给予二甲双胍500 mg•kg^(-1)•d^(-1)灌胃,低剂量SVPr组、中剂量SVPr组、高剂量SVPr组大鼠分别经尾静脉注射质量浓度为1.47、2.94、4.41 g•L^(-1)的SVPr溶液0.1 mL,对照组及模型组大鼠注射等量生理盐水,每日1次,持续给药4周。采用生物化学法检测各组大鼠血尿素氮(BUN)、血肌酐(SCr)、血糖、24 h尿蛋白水平,酶联免疫吸附试验法检测各组大鼠肾组织中活性氧(ROS)、核因子-κB(NF-κB)水平,Western blot法检测各组大鼠肾组织中沉默调节蛋白1(SIRT1)、核因子E2相关因子2(Nrf-2)、血红素加氧酶-1(HO-1)蛋白相对表达量。结果模型组大鼠BUN、SCr、24 h尿蛋白、血糖水平均显著高于对照组(P<0.05);低剂量SVPr组、中剂量SVPr组、高剂量SVPr组和二甲双胍组大鼠BUN、SCr、24 h尿蛋白、血糖水平显著低于模型组(P<0.05);高剂量SVPr组大鼠SCr、24 h尿蛋白水平显著低于二甲双胍组(P<0.05),高剂量SVPr组与二甲双胍组大鼠BUN、血糖水平比较差异无统计学意义(P>0.05);中剂量SVPr组大鼠SCr水平显著低于二甲双胍组,BUN、血糖水平显著高于二甲双胍组(P<0.05);中剂量SVPr组与二甲双胍组大鼠24 h尿蛋白水平比较差异无统计学意义(P>0.05);低剂量SVPr组大鼠BUN、24 h尿蛋白、血糖水平显著高于二甲双胍组(P<0.05),低剂量SVPr组与二甲双胍组大鼠SCr水平比较差异无统计学意义(P>0.05)。高剂量SVPr组大鼠BUN、血糖、24 h尿蛋白、SCr水平显著低于中剂量SVPr和低剂量SVPr组,中剂量SVPr组BUN、血糖、24 h尿蛋白、SCr水平显著低于低剂量SVPr组(P<0.05)。模型组大鼠肾组织中ROS、NF-κB水平显著高于对照组(P<0.05);低剂量SVPr组、中剂量SVPr组、高剂量SVPr组和二甲双胍组大鼠肾组织中ROS、NF-κB水平显著低于模型组(P<0.05);高剂量SVPr组大鼠肾组织中ROS、NF-κB水平显著低于二甲双胍组(P<0.05);中剂量SVPr组大鼠肾组织中ROS水平显著高于二甲双胍组(P<0.05),中剂量SVPr组与二甲双胍组大鼠肾组织中NF-κB水平差异无统计学意义(P>0.05);低剂量SVPr组大鼠肾组织中ROS、NF-κB水平显著高于二甲双胍组(P<0.05);高剂量SVPr组大鼠肾组织中ROS、NF-κB水平显著低于中剂量SVPr组和低剂量SVPr组;中剂量SVPr组大鼠肾组织中ROS水平显著低于低剂量SVPr组(P<0.05),中剂量SVPr组与低剂量SVPr组大鼠肾组织中NF-κB水平比较差异无统计学意义(P>0.05)。模型组大鼠肾组织中SIRT1、Nrf-2、HO-1相对表达量均显著低于对照组(P<0.05);低剂量SVPr组、中剂量SVPr组、高剂量SVPr组和二甲双胍组大鼠肾组织中SIRT1、Nrf-2、HO-1相对表达量显著高于模型组(P<0.05);高剂量SVPr组大鼠肾组织中SIRT1、Nrf-2相对表达量显著高于二甲双胍组(P<0.05),高剂量SVPr组与二甲双胍组大鼠肾组织中HO-1相对表达量比较差异无统计学意义(P>0.05);中剂量SVPr组大鼠肾组织中SIRT1、Nrf-2相对表达量显著高于二甲双胍组,HO-1相对表达量显著低于二甲双胍组(P<0.05);低剂量SVPr组大鼠肾组织中SIRT1相对表达量显著高于二甲双胍组(P<0.05),低剂量SVPr组与二甲双胍组大鼠肾组织中Nrf-2、HO-1相对表达量比较差异无统计学意义(P>0.05);高剂量SVPr组大鼠肾组织中SIRT1、Nrf-2、HO-1相对表达量显著高于中剂量SVPr组和低剂量SVPr组,中剂量SVPr组大鼠肾组织中SIRT1、Nrf-2、HO-1相对表达量显著高于低剂量SVPr组(P<0.05)。结论SVPr可通过上调SIRT1表达来抑制NF-κB转录活性、激活HO-1/Nrf-2抗氧化应激信号,减轻DN大鼠肾损伤。

鹿茸多肽对训练创伤致脊髓损伤模型大鼠的作用及机制

目的探讨鹿茸多肽(VAP)对训练创伤致脊髓损伤(SCI)模型大鼠的作用及机制。方法将48只SD雄性大鼠随机分为空白(Control)组、模型(SCI)组、阳性对照(MSI-1436)组及VAP低、中、高剂量组(20,40,60 mg/kg),各8只。适应性饲养2 d后,结扎坐骨神经复制SCI模型,MSI-1436组大鼠术后14 d鞘内注射4μg MSI-1436(溶于20μL生理盐水)1次(单次给药),并于术后14,15,16 d各给药1次(连续给药);VAP低、中、高剂量组大鼠术后14 d分别腹腔注射20,40,60 mg/kg VAP 1次(单次给药),并于术后15,16,17,18 d各给药1次(连续给药);Control组和SCI组大鼠均给予等量生理盐水。使用Von Frey纤维丝测量大鼠的机械痛觉阈值和热痛觉潜伏期;采用免疫印迹(Western blot)法测定大鼠脊髓中多聚嘧啶序列结合蛋白(PTB)、磷酸化c-Jun氨基端蛋白激酶(p-JNK)、磷酸化p38(p-p38)、磷酸化胞外信号调节激酶(p-ERK)及炎性因子肿瘤坏死因子-α(TNF-α)和白细胞介素1β(IL-1β)的蛋白表达水平;采用免疫荧光化学法检测脊髓中神经元特异性烯醇化酶(NSE)的蛋白表达水平。结果与SCI组比较,VAP中、高剂量组大鼠单次给药2.0,4.0,8.0 h时同侧足的机械痛觉阈值均显著升高,热痛觉潜伏期均显著延长(P<0.05);VAP中剂量组大鼠连续给药5 d时同侧足的机械痛觉阈值均显著升高,热痛觉潜伏期均显著延长(P<0.05);VAP低、中、高剂量组大鼠脊髓中p-p38,p-JNK,PTB,IL-1β,TNF-α的蛋白表达水平均显著降低(P<0.05);VAP中、高剂量组大鼠脊髓中NSE的蛋白表达水平显著降低(P<0.05)。结论VAP可能通过抑制PTB的表达发挥对SCI模型大鼠的神经性疼痛和神经炎症的治疗作用,并促进神经修复。

鹿茸蛋白的提取分离及其抗肿瘤活性

鹿茸粉脱脂后，用ＮａＣｌ－ＨＣｌ缓冲液（ｐＨ６）提取，应用ＳｅｐｈａｄｅｘＧ－５０层析柱分离纯化后，获得鹿茸蛋白。给腹腔接种Ｓ１８０型小鼠口服鹿茸蛋白提取物，观察生存时间，结果表明，口服鹿茸蛋白的试验组与对照组生存时间相比，差异显著（Ｐ＜００５）。

梅花鹿茸可溶性蛋白提取工艺及免疫活性

以梅花鹿茸为原料,采用超声波辅助法提取可溶性蛋白。以鹿茸可溶性蛋白得率为评价指标,通过单因素试验研究提取溶剂浓度、超声提取时间、超声提取功率和液料比对鹿茸可溶性蛋白得率的影响,在单因素试验的基础上进行正交试验,优化提取工艺条件。结果表明:鹿茸可溶性蛋白的最优提取工艺条件为,以pH=10.00、0.05 mol·L-1的碳酸盐缓冲溶液为提取溶剂,液料比10∶1,超声提取功率200W,超声提取时间20min。在此条件下,鹿茸可溶性蛋白得率为36.849mg·g-1。体内免疫活性试验表明,鹿茸蛋白提取物能够提高免疫功能低下小鼠的单核巨噬细胞吞噬指数、血清溶菌酶质量浓度、血清及肝组织中酸性磷酸酶活力,具有良好的免疫活性。

鹿茸蛋白2种不同提取方法的比较研究

目的探讨从鹿茸中获得促进神经细胞损伤修复蛋白的最佳提取方法。方法将新鲜鹿茸分别采用匀浆法和超微粉碎法获取鹿茸蛋白混合物(velvet antler proteins,VAPs);用Bradford法及SDS-PAGE检测并比较蛋白含量及蛋白组分差别;用扫描电镜观察不同提取方法超微结构不同。建立1-甲基-4-苯基吡啶离子(1-methyl-4-phenylpyridinium,MPP+)MPP+诱导神经母细胞瘤细胞SH-SY5Y损伤模型,用该模型观察不同提取方法所得蛋白对损伤恢复的影响。结果超微粉碎法提取的鹿茸蛋白得率更高,得到的蛋白质条带更多,图谱清晰;电镜结果表明超微粉碎法得到的鹿茸蛋白干粉均无细胞结构,且颗粒较细;活性检测中,匀浆法提取的鹿茸蛋白从125μg/m L浓度开始可显著提高1m M MPP+作用下SH-SY5Y细胞的增殖率,而超微粉碎法提取的鹿茸蛋白的最低有效浓度为62.5μg/m L,促增殖率可达到25.45%。结论超微粉碎法既能大量提取鹿茸蛋白又能最大限度保证蛋白促细胞增殖活性,是较为理想的蛋白提取方式。

梅花鹿鹿茸总蛋白对庆大霉素诱导肾毒性的保护作用及其机制

目的研究梅花鹿鹿茸总蛋白(SVPr)对庆大霉素(GM)诱导的肾损伤的保护作用及其机制。方法(1)体外培养HEK293细胞分为正常对照组(给予等量PBS)、GM模型组(GM 3 g·L^(-1)孵育24 h)和GM+SVPr组(给予SVPr 1,2和4 g·L^(-1)孵育24 h后,分别加入GM 3 g·L^(-1)共同孵育24 h)。以MTT法测定GM对HEK293细胞存活率的影响;以生化试剂盒方法分别测定HEK293细胞培养上清液中乳酸脱氢酶(LDH)含量、细胞裂解液中谷胱甘肽(GSH)和丙二醛(MDA)含量及超氧化物歧化酶(SOD)活性。(2)将42只ICR小鼠随机分为正常对照组(ig蒸馏水10 d,第3～10天ip给予生理盐水)、GM模型组(ig蒸馏水10 d,第3～10天ip给予GM 100 mg·kg^(-1))、阳性对照组(ig给予芥子酸20 mg·kg^(-1)10 d,第3～10天给药前6 h ip给予GM100 mg·kg^(-1))和SVPr组(分别ig给予SVPr 50,100和200 mg·kg^(-1)10 d,第3～10天给药前6 h ip给予GM100 mg·kg^(-1))。实验结束后记录小鼠体质量和肾质量,计算肾指数;以生化试剂盒方法分别检测小鼠血清中血尿素氮(BUN)和肌酐(Cr)的水平,肾组织中过氧化氢酶(CAT)和SOD活性、MDA和GSH含量;ELISA法检测血清中肿瘤坏死因子α(TNF-α)和白细胞介素6(IL-6)水平;HE染色观察肾组织病理变化。结果体外细胞实验结果表明,SVPr 1,2和4 g·L^(-1)预处理可缓解GM 3 g·L^(-1)诱导的HEK293细胞存活率的降低(P<0.01);缓解GM诱导的HEK293细胞GSH和SOD的降低,及MDA和LDH水平的升高(P<0.01)。小鼠实验结果表明,SVPr 50,100和200 mg·kg^(-1)和阳性药芥子酸20 mg·kg^(-1)均显著抑制GM 100 mg·kg^(-1)诱导的小鼠肾指数、BUN、Cr、MDA、TNF-α和IL-6水平的升高(P<0.05,P<0.01),以及SOD,CAT和GSH水平的降低(P<0.05,P<0.01),并改善肾组织病理变化。结论 SVPr可有效减轻GM诱导的小鼠肾损伤,其机制可能与抑制氧化应激和炎症反应有关。

鹿茸蛋白促进小鼠骨折愈合的实验研究

研究鹿茸蛋白(VAP)对小鼠骨折愈合的影响。采用X光检查、组织病理切片、血清中胰岛素样生长因子1(IGF-1)和碱性磷酸酶(ALP)含量测定等方法,观察肌肉注射VAP对骨折模型小鼠的影响。与对照组和接骨片组相比,肌肉注射VAP的小鼠骨折愈合明显加快。X光检查结果显示,58mg/kg VAP组骨折线消失且骨髓腔通畅,有明显促进小鼠骨折愈合的作用;HE染色实验结果证明,58mg/kg VAP使骨性连接更加稠密,骨髓腔充满大量骨髓细胞;给予58mg/kg VAP的小鼠血清中IGF-1和ALP含量较对照组和接骨片组更高。58mg/kg VAP可以加速骨形成和骨折愈合,其治疗效果与小鼠血清中IGF-1和ALP的浓度相关。

鹿茸水提取物及其蛋白酶解物对小鼠脾淋巴细胞增殖的影响

研究了鹿茸水提取物中非蛋白成分、粗蛋白酶解物及分离组分对小鼠脾淋巴细胞增殖的影响.非蛋白成分和酶解物的分离分别采用HPLC法和超滤法.应用WST-8法检测各分离组分对小鼠脾淋巴细胞增殖的影响,采用高分辨质谱对非蛋白成分进行初步鉴定.结果显示,非蛋白成分对未经刀豆蛋白A(ConA)诱导的小鼠脾细胞增殖的促进作用优于其分离组分,Fr.Ⅲ和Ⅳ对ConA诱导的脾淋巴细胞增殖有抑制作用,初步鉴定其为碱基和核苷酸的混合物.分子量大于10 kDa的肽段,单独可刺激小鼠脾细胞增殖,且对ConA诱导的T淋巴细胞增殖有抑制作用.肽段分子量大小对其免疫调节活性影响较大,但并未呈现直接的相关性.肽的氨基酸组成、序列及构型等也是影响其活性的重要因素.

马鹿茸水溶性蛋白的提取与体外模拟消化研究

以鲜马鹿茸为原料,对比六种蛋白提取方法,依据提取蛋白量及SDS-PAGE电泳图谱确定鹿茸水溶性蛋白有效提取方法;模拟胃肠环境对提取的蛋白进行体外模拟消化研究,测定其体外胃肠消化稳定性及消化过程中游离氨基含量变化。结果表明:组成为100mmol/L Tris、6mol/L盐酸胍、0.02mol/L EDTA-2Na和1%胃蛋白酶抑制剂的提取液提取蛋白量最高,电泳条带多且清晰;蛋白在体外模拟胃、肠环境下消化5min后即迅速被分解,消化60min后即被分解为20ku以下的小分子量蛋白或多肽,消化2.5h后分子量主要分布在7823u及以下范围,在肠和胃肠连续消化过程中游离氨基含量随时间的延长而显著增加,这表明鹿茸水溶性蛋白较易被分解;模拟肠消化2.5h后游离氨基含量增加了一倍,显著大于胃消化中的增加量(p<0.01),这暗示着鹿茸水溶性蛋白更有利于肠消化。

鹿瓜多肽注射液对去卵巢大鼠骨密度及松质骨中骨形态发生蛋白表达的影响

目的探讨鹿瓜多肽(松梅乐)注射液肌肉注射对去卵巢大鼠骨密度及松质骨中骨形态发生蛋白(BMP2)表达的影响。方法将8月龄未经产雌性二级SD大鼠30只,随机分为假手术(SHAM)组、去势(VOX)组、去势+鹿瓜多肽(VOX+SML)组。VOX+SML组大鼠术后第2天开始给药。术后20周处死各组大鼠,对各组大鼠骨密度进行检测。利用免疫组织化学染色及图像分析方法对各组大鼠松质骨切片图像进行灰度分析,观察鹿瓜多肽注射对去势大鼠腰椎松质骨中BMP2表达的影响。结果①去势组与SHAM组相比较,灰度值降低,而(VOX+SML)治疗组较VOX组灰度值降低,表明VOX大鼠松质骨中骨小梁周围及髓腔内BMP2表达阳性细胞数明显多于SHAM组;而(VOX+SML)治疗组骨小梁周围及髓腔内BMP2表达阳性细胞数多于VOX组,且染色加深。②与SHAM组相比,VOX组股骨近端、股骨干、腰椎的骨密度明显降低(P<0.01);(VOX+SML)治疗组各部位的骨密度高于VOX组(P<0.05),但未达到SHAM组水平(P>0.05)。结论鹿瓜多肽注射液可抑制和延缓骨质疏松形成,对雌激素缺乏引起的骨质疏松具有预防作用。

鹿茸多肽对人骨髓间充质干细胞BMP-2和Runx2表达的影响

目的:探讨鹿茸多肽(VAP)对人骨髓间充质干细胞(hBMSCs)中骨形态发生蛋白2(BMP-2)和骨特异性转录因子2(Runx2)基因和蛋白表达的影响,阐明其对骨合成及hBMSCs向成骨细胞方向分化的作用机制。方法:体外培养的hBMSCs分为对照组和5、10、15、20g·L-1 VAP组,通过检测各组hBMSCs中碱性磷酸酶(ALP)活性,确定体外用药最佳药物浓度;CCK-8法检测对照组和10g·L-1 VAP组hBMSCs增殖情况;荧光定量PCR法与Western blotting法测定对照组和10g·L-1 VAP组hBMSCs中BMP-2和Runx2基因与蛋白的表达。结果:VAP各组细胞中ALP活性均高于对照组,其中以10g·L-1 VAP组细胞中ALP活性最高(P<0.01);CCK-8法,10g·L-1 VAP组hBMSCs增殖率明显高于对照组(P<0.05),VAP诱导培养第9天hBMSCs增殖率最高,且进入平台期,之后hBMSCs的增殖率开始下降;荧光定量PCR和Western blotting检测,10g·L-1 VAP组hBMSCs中BMP-2和Runx2基因及蛋白表达水平明显高于对照组,差异有统计学意义(P<0.05)。结论:VAP能够提高hBMSCs中ALP活性,促进hBMSCs增殖分化,上调hBMSCs中BMP-2及其下游Runx2基因和蛋白的表达,这可能是VAP对hBMSCs骨形成及骨代谢影响的分子调控机制之一。

鹿茸多肽对轻度认知功能障碍大鼠学习记忆能力的改善作用及其调节Keap1/Nrf2/HO-1信号通路的机制

目的:观察鹿茸多肽(VAP)对轻度认知功能障碍(MCI)模型大鼠学习和记忆能力及海马组织中KELCH状ECH相关蛋白1(Keap1)/核因子E2相关因子2(Nrf2)/血红素氧合酶1(HO-1)信号通路相关蛋白表达的影响,并探讨其作用机制。方法:50只清洁级Wistar大鼠随机分为正常对照组、MCI组、吡拉西坦组、低剂量VAP组和高剂量VAP组,每组10只,其中吡拉西坦组灌胃500 mg·kg^(-1)吡拉西坦,低剂量VAP组大鼠灌胃200 mg·kg^(-1)VAP,高剂量VAP组大鼠灌胃300 mg·kg^(-1)VAP,灌胃给药共18 d,第18天给药2 h后,采用腹腔中注射东莨菪碱诱导并复制MCI大鼠模型。Morris水迷宫实验观察各组大鼠行为学,HE染色观察活性大鼠海马组织病理形态表现,ELISA法检测各组大鼠血清中超氧化物歧化酶(SOD)活性和丙二醛(MDA)水平,Western blotting法检测各组大鼠海马组织中Keap1、Nrf2和HO-1蛋白表达水平。结果:Morris水迷宫实验,与正常对照组比较,MCI组大鼠逃避潜伏期和行为路径明显延长(P<0.01),穿过平台位置次数和有效区停留时间明显降低(P<0.01);与MCI组比较,吡拉西坦组、低剂量VAP组和高剂量VAP组大鼠逃避潜伏期时间明显降低(P<0.01),吡拉西坦组和高剂量VAP组大鼠行为路径明显缩短(P<0.01),吡拉西坦组、低剂量VAP组和高剂量VAP组大鼠穿过平台位置次数和有效区停留时间明显升高(P<0.05或P<0.01)。HE染色,与正常对照组比较,MCI组大鼠海马组织中细胞数量明显减少,且排列方式由有序变为相对混乱;与MCI组比较,吡拉西坦组和高剂量VAP组大鼠海马组织细胞排列较整齐,形态略规则。ELISA法检测,与正常对照组比较,MCI组大鼠血清中SOD活性明显降低(P<0.01),MDA水平明显升高(P<0.01);与MCI组比较,吡拉西坦组和高剂量VAP组大鼠血清中SOD活性明显升高(P<0.01),MDA水平明显降低(P<0.01)。Western blotting法检测,与正常对照组比较,MCI组大鼠海马组织中Keap1蛋白表达水平明显升高(P<0.01),Nrf2和HO-1蛋白表达水平明显降低(P<0.05或P<0.01);与MCI组比较,吡拉西坦组、低剂量VAP组和高剂量VAP组大鼠海马组织中Keap1蛋白表达水平明显降低(P<0.01),Nrf2和HO-1蛋白表达水平明显升高(P<0.01)。结论:VAP能够改善腹腔注射东莨菪碱诱导并复制的MCI模型大鼠的学习和记忆能力,其机制可能与提高模型大鼠海马组织中Keap1、Nrf2和HO-1蛋白表达水平进而发挥抗氧化应激作用有关。

马鹿茸中水溶性蛋白质的含量测定及其影响因素考察

建立马鹿茸中水溶性蛋白质含量测定方法,并探讨干燥方法、储存时间对其含量的影响。采用考马斯亮蓝显色法测定马鹿茸中水溶性蛋白质的含量。样品中水溶性蛋白质的含量以牛血清蛋白计在5μg/m L^40μg/m L范围内具有良好线性关系,回归方程为y=0.0231x+0.1114(R2=0.995),平均回收率为99.33%,RSD为0.86%;马鹿茸水溶性蛋白含量随储存时间延长而下降,高温干燥比低温干燥含量低。采用考马斯亮蓝显色法测定马鹿茸水溶性蛋白质的含量,方法简便、可靠,可作为马鹿茸质量控制的方法。存储时间、干燥方法对马鹿茸水溶性蛋白含量有影响,在马鹿茸生产过程中要注意。

鹿茸不同有效部位的抗氧化活性与对RAW264.7细胞的免疫调节作用研究

目的研究鹿茸不同有效部位的抗氧化活性与对RAW264.7细胞的免疫调节作用。方法测定鹿茸多糖、鹿茸蛋白和鹿茸水提物的抗氧化活性,MTT法测定对RAW264.7细胞增殖能力的影响、中性红吞噬实验测定对RAW264.7细胞吞噬能力影响,最后测定其对细胞因子的分泌和mRNA表达的影响。结果鹿茸多糖、鹿茸蛋白和鹿茸水提物对ABTS自由基最大清除率分别为89.31%、81.46%和99.38%;对OH自由基最大清除率分别为48.54%、39.18%和56.70%。在12.5~50μg/mL浓度范围内均能增强RAW 264.7细胞的增殖能力、吞噬能力和白细胞介素-1β(IL-1β)、白细胞介素-6(IL-6)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)mRNA表达及相关细胞因子的分泌。结论3种鹿茸不同有效部位均有一定的免疫调节作用,其中以鹿茸多糖的活性最强。结果揭示了鹿茸潜在的提高免疫作用,为将来鹿茸系列产品的开发提供理论依据。

鹿茸中多种水溶性成分的综合提取工艺的研究

为了建立鹿茸中3个水溶性成分的综合提取工艺,获得高纯度的鹿茸蛋白、鹿茸多糖及鹿茸胶原蛋白,以充分利用鹿茸资源,扩展鹿茸的应用范围。依次采用低浓度乙醇回流法、煎煮法和复合酶解法,自鹿茸中提取鹿茸蛋白、多糖及胶原蛋白,其中对蛋白提取溶剂浓度、提取时间和料液比进行了单因素优化,对多糖提取方法、提取时间和料液比进行了单因素优化,以各组分提取质量为指标,计算得率和提取率;以Bradford法、苯酚-硫酸法、羟脯氨酸法分别测定蛋白、多糖和胶原蛋白的含量;明确了鹿茸中多种水溶性成分综合提取工艺参数;并以不同种类鹿茸的多种水溶性成分的综合提取进行提取工艺的验证。结果显示,鹿茸中水溶性成分的最佳综合提取工艺为:鹿茸粉经乙醚及95%乙醇脱之后,以35%乙醇为溶剂,回流提取2 h,获得鹿茸蛋白;残渣煎煮3次,1 h/次,获得鹿茸多糖;残渣加入0.5 mol/L醋酸溶液和4%胃蛋白酶于37℃下提取6 h得鹿茸胶原蛋白。采用此系统工艺提取法,花二杠茸、花鹿三岔茸、马鹿二杠茸和马鹿三岔茸中蛋白提取率分别为20.100%、18.379%、17.285%和14.130%,含量达88.250%以上;多糖提取率分别为4.760%、4.588%、4.255%和3.981%,含量达89.450%以上;胶原蛋白提取率分别为3.983%、3.728%、3.522%和2.836%,含量达88.600%以上。表明采用本提取工艺可顺序提取鹿茸中多种水溶性物质,获得高纯度的鹿茸蛋白、多糖及胶原蛋白;相同鹿源鹿茸的二杠茸水溶性成分含量高于三岔茸水溶性成分含量;花鹿茸水溶性成分含量高于马鹿茸水溶性成分含量。此工艺简单,安全易行,提取率稳定,适于推广。

龟甲人参鹿茸片主成分组方合理性研究

以龟甲人参鹿茸片主成分的可溶性蛋白质及多糖含量、对小鼠体液免疫作用程度为指标,探讨龟甲人参鹿茸片组方合理性。结果表明,由龟甲2 g,人参3 g,马鹿茸0.5 g构成的组方2中的可溶性蛋白质、多糖含量最高,分别为1 159.8,62.0μg/m L。3种组方中,组方2的促进小鼠B细胞抗体产生的能力强,增加小鼠半数溶血值(HC_(50))最多,促进小鼠体液免疫功能增强最多,是龟甲人参鹿茸片组方主成分的合理组成。

微粉化对鹿茸粉体的影响

对梅花鹿茸进行超微粉碎,并对鹿茸细粉和微粉的粉体学特征进行了系统的比较研究。在扫描电子显微镜下观察了粉体的显微结构,通过激光粒度分析仪测定微粉粒径、粒径分布宽度和比表面积,检测粉体的休止角、堆密度、水溶性蛋白含量和水溶性浸出物的累计溶出度。结果表明微粉化使鹿茸粉体粒径明显变小,比表面积增大,能增加鹿茸水溶性蛋白质和水溶性浸出物的溶出度,可充分有效的利用鹿茸,增强药效,为开发新剂型奠定了基础。

梅花鹿茸顶端组织中骨形成蛋白和转移生长因子的分布

目的:研究鹿茸顶部组织中骨形态发生蛋白(BMPs)、转化生长因子-β(TGF-β)的分布,探索鹿茸生长发育机制。方法:采用免疫组织化学技术,观察和半定量分析了BMPs、TGF-β1在梅花鹿茸顶部组织细胞中的分布情况。结果:BMPs在表皮的基底细胞、毛囊细胞中均有强烈表达,真皮内的细胞、间充质细胞和前成软骨细胞无阳性反应,随着细胞的不断分化阳性细胞增加,软骨细胞有强阳性反应。从表皮向内,经真皮到间充质层,细胞外间质的BMPs棕黄色阳性反应渐渐减弱,平均总累计光密度值(IOD)由最高降至最低,从前成软骨层、过渡层到软骨层IOD又逐渐升高,但仍明显低于表皮层(P<0.01)。TGF-β1在各层均有分布,IOD值存在显著差异(P<0.05),从大到小按软骨层、过渡层、茸皮血管层、前成软骨层、间充质层、表皮层、毛囊层排列,血窦、血管和管膜形成区表达较强。结论:在梅花鹿茸顶部BMPs主要分布于表皮、毛囊和软骨层中,但表皮中的表达量最高,TGF-β1以不同的表达量分布于各层。