饮用水处理工艺中VBNC状态细菌研究现状

活的非可培养(viable but non-culturable,VBNC)状态是某些细菌在不良环境中进入的一种特殊休眠状态,在条件适宜时可复苏并恢复其致病性,因此,VBNC状态的水源性致病菌会对饮用水安全和人类健康造成潜在威胁。文中简要综述了饮用水处理工艺中VBNC细菌的研究现状,分析了VBNC状态细菌形成和复苏的影响条件和作用机制,探讨了常规饮用水处理工艺对VBNC细菌的影响。论文可为有效控制饮用水中VBNC细菌、保障饮用水安全提供一定的参考。

不同诱导条件下的VBNC状态副溶血弧菌的PMA-qPCR定量检测及其呼吸活性分析

定量检测不同诱导条件下的活的非可培养(viable but non-culturable,VBNC)状态副溶血弧菌的变化情况,并对VBNC菌的呼吸活性进行分析。采用叠氮溴化丙锭(propidium monoazide,PMA)与荧光定量聚合酶链式反应(fluorescence quantitative polymerase chain reaction,q PCR)结合的技术(PMA-q PCR)定量检测副溶血弧菌活菌数。结合激光扫描共聚焦显微镜和流式细胞仪优化传统CTC(5-cyano-2,3-ditolyl tetrazolium chloride)呼吸检测法对VBNC状态的副溶血弧菌进行分析。结果表明PMA-q PCR检测技术结合平板计数的方法,可用于定量检测副溶血弧菌诱导过程中活菌数和可培养菌数的变化情况,并利用差值测定出VBNC细胞的浓度。在不同的温度、Na Cl含量和氯霉素含量的诱导条件下,副溶血弧菌在其中的7种条件下在60 d内进入了VBNC状态。VBNC细胞终浓度最低为5.75×10~2 CFU/m L,最高为1.70×10~5 CFU/m L。在细胞呼吸实验中,采用CTC与4’,6-二脒基-2-苯基吲哚(4’,6-diamidino-2-phenylindole,DAPI)双染法能在激光扫描共聚焦显微镜下清晰地观察到VBNC细胞表面的红色荧光,有效区分死活细胞。同时利用流式细胞仪能够根据荧光强度快速区分呼吸活性呈阴性和阳性的细胞。本研究为VBNC细菌的检测和生理特性的研究提供了新的思路和依据。

芳樟醇诱导肠炎沙门氏菌进入活的不可培养状态的研究

芳樟醇可有效降低食品在生产过程中受致病菌污染而引起食源性疾病的概率。鲜有关注由芳樟醇诱导活的不可培养状态(VBNC)细菌的抗性以及其复苏研究。采用二倍稀释法测定芳樟醇对肠炎沙门氏菌的最小抑菌浓度(MIC)为0.4%(V/V),通过PMAxx-qPCR方法对比可培养菌体细胞与VBNC状态的肠炎沙门氏菌对热、柠檬酸、乙酸、乳酸、头孢曲松钠、左氧氟沙星以及过氧化氢的耐受能力差异。采用丙酮酸钠、过氧化氢酶及对数期沙门氏菌无菌上清对VBNC细菌进行复苏。结果表明,芳樟醇诱导的VBNC状态的肠炎沙门氏菌对热、酸、抗生素的耐受能力均弱于可培养状态细胞,而对过氧化氢的耐受能力显著高于可培养沙门氏菌。经过72 h处理,只有过氧化氢酶成功复苏约(5.51±0.08)lg(CFU/mL)的肠炎沙门氏菌。通过测定可培养、VBNC以及复苏菌株内活性氧差异,表明活性氧的积累在菌体VBNC状态形成中的重要作用。本研究为监控天然抑菌物质使用过程中VBNC细菌的形成及其可能产生的食品安全问题提供了研究思路和科学依据。

基于VBNC状态复苏的荧光假单胞杆菌CHZYR63对毒死蜱的酶降解效果

利用复苏可培养化VBNC(Viable but non-culturable bacteria)资源菌筛选了对毒死蜱有降解性能的菌种及其酶.应用最大或然数计数(MPN)法,添加复苏促进因子Rpf蛋白分子,获取可培养化VBNC菌种,确定菌种的系统进化属性,并用常规培养法筛选了高效毒死蜱降解菌及其酶,探索了适宜的酶降解优化条件.从分离到的可培养化VBNC菌株中筛选出一株降解毒死蜱效果达70%的菌株CHZYR63,经16S r RNA基因序列分析,初步鉴定为荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens).继而,从该菌株提取出粗酶,其降解毒死蜱能力为50%.降解条件优化研究表明:降解酶促反应的最适温度为35℃,最适p H值为7;在最适条件下该降解酶在30 min内对毒死蜱(100 mg/L)的降解率可达60.26%.

益生菌干酪乳杆菌Zhang VBNC态和正常态的代谢组学研究

采用液相色谱-质谱联用技术(LC-MS)检测分析了干酪乳杆菌Zhang的VBNC态和正常态两种细胞的代谢组差异。结果显示,在正离子和负离子模式下分别检测到874个和368个代谢物质,根据P<0.05、差异倍数>2和VIP≥1筛选原则,通过数据库比对鉴定得到干酪乳杆菌Zhang在两种状态下的主要差异代谢物有24种,主要包括氨基酸类、糖类、维生素类等6类,随后按类分析了这些物质在干酪乳杆菌Zhang生存过程中的作用,为探索干酪乳杆菌Zhang VBNC态在逆境条件下的存活机理提供一定的参考。

干酪乳酪杆菌Zhang VBNC态在不同复苏基质中的代谢物组学研究

利用超高效液相色谱-四级杆飞行时间质谱技术(UPLC-Q-TOF MS)检测分析了干酪乳酪杆菌Zhang(Lacticaseibacillus casei Zhang,L.casei Zhang)VBNC态在液体MRS培养基、脱脂乳二种复苏基质中的代谢物差异。结果显示:在正离子和负离子模式下分别检测到2735种和1717种代谢物质。采用Metaboanalyst 5.0及SIMCA 14.1软件对代谢物进行分析,结合P<0.05、差异倍数>2和VIP≥1相结合的条件,共筛选出差异代谢物22种,归属于氨基酸、糖类、维生素、脂类和嘌呤类5大类,其中,甘氨酸、L-谷氨酰胺、低聚木糖和烟酰胺等18种代谢物在液体MRS培养基中的相对含量显著高于脱脂乳,其余4种(S-核糖基-L-高半胱氨酸、乳糖、核黄素和(R)-3-羟基丁酸酯)代谢物在脱脂乳中相对高些,并从成分角度研究分析了这些代谢物在L.casei Zhang VBNC态复苏中的可能作用,为初步探讨L.casei Zhang VBNC态的复苏机理提供了参考。

细菌VBNC态检测技术的研究进展

细菌在一些不良压力条件下会进入"活的非可培养状态"(viable but non-culturable,VBNC),其仍具有活力但不能采用常规的平板培养基进行培养,VBNC态细菌一旦培养条件适宜仍能继续生长繁殖,有些致病菌依旧具有毒力。如果检测方法不当,会造成假阳性或假阴性的结果,需要采取适合的检测方法进行检测。文章概述了几种检测VBNC态细菌的方法,如活菌直接计数法、核酸染料检测法、呼吸检测法、分子生物学法、免疫学法、流式细胞仪检测法等,并对检测方法的应用现状进行了评述。

弧菌VBNC状态的研究进展

细菌的活的非可培养(VBNC,VNC)状态是在不良环境下细菌具有生物活性和毒性,用常规培养法无法检出,却在一定条件下可以复苏并保存致病性的一种特殊生理状态。本文综述了三种常见致病性弧菌的活的非可培养状态下的生物学特性、形成机制及其复苏的研究。运用现代生物技术手段,深入地研究细菌的VBNC状态,对食品卫生与安全具有重要的意义。

不同寡营养条件下副溶血性弧菌的异质性比较

采用稀释培养基的方法模拟了不同寡营养环境,分析了副溶血性弧菌在不同稀释度培养基中的生长和被膜形成异质性以及在人工海水培养条件下进入活得不可培养状态的异质性。结果表明:副溶血性弧菌在不同寡营养条件下具有较大的生长变异性;环境菌株的生物被膜形成能力比临床菌株的生物被膜形成能力强,且在不同寡营养条件下的被膜形成具有较大变异性;在低温人工海水培养50 d后,副溶血性弧菌菌株并未全部进入活得不可培养状态,且细菌细胞的形态发生变化。比较了副溶血性弧菌在不同寡营养条件下的异质性,以期为开展精准的风险评估提供理论依据。

单增李斯特菌非可培养状态的诱导与PMA-qPCR检测

在9%(w/v)NaCl条件下,通过温度、pH两种因素诱导一株单增李斯特菌进入"活的非可培养"(viable but non-cuturable,VBNC)状态。通过LIVE/DEAD Baclight活菌检测试剂盒检测细菌总数与活菌数,比较单增李斯特菌状态及数量的差异与变化。结果显示,在2℃、pH6.0条件下单增李斯特菌活菌全部进入VBNC状态。用PMA-qPCR对经诱导的四份菌液进行检测,结果表明该方法能快速、准确地测出死菌背景下的活的单增李斯特菌。

热处理辣椒酱贮藏过程中残留微生物分析

四川郫县辣椒酱多采用热处理控制微生物生长以延长货架期,但热处理后残留微生物仍会导致辣椒酱腐败。辣椒酱经80℃、30min热处理后室温贮藏120d期间检测其中菌落总数、大肠菌群、霉菌和酵母数,分别采用16SrDNA和ITS序列鉴定分离的细菌和真菌菌株,并运用PCR-DGGE法分析贮藏终点辣椒酱中细菌群落结构。结果表明:热处理后辣椒酱中微生物减少了90%以上,残留微生物主要为芽孢杆菌(Bacillus sp.),在贮藏期内微生物数量则呈先上升后下降的趋势;PCR-DGGE检测发现贮藏终点辣椒酱中主要残留细菌为乳酸菌(Pediococcus sp.和Lac-tobacillus sp.)和蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)。因此,热处理可使辣椒酱中部分微生物致死、亚致死或转为"存活但非可培养"(viable but non-culturable,VBNC)状态,但残留的芽孢杆菌(Bacillus sp.)和乳酸菌可能导致辣椒酱的腐败。有效控制芽孢杆菌将是延长辣椒酱货架期的关键因素。

非可培养状态霍乱弧菌的间接免疫荧光检测

目的建立检测水中活的非可培养状态霍乱弧菌(O1群、O139群)的间接免疫荧光法。方法用本实验室人工转化的非可培养状态霍乱弧菌的菌液制成抗原片,用混合诊断血清(抗O1群、O139群)作为一抗,异硫氰酸荧光素(FITC)标记猪抗兔IgG作为二抗,进行间接免疫荧光检测。结果该方法可以成功检测出水中非可培养状态霍乱弧菌,其检测下限约为104cells/400 ml。结论该方法具有较好的特异性和灵敏度,可作为自然水体中非可培养状态霍乱弧菌的检测方法,用于霍乱弧菌的生态研究。

细菌活的非可培养状态研究

综述了细菌活的非可培养状态的导致原因、生物学特性、检测及复苏方法,通过对活的非可培养状态的研究,使相关研究人员更加深刻的了解和认识活的非可培养状态下的细菌特性,从而对非可培养状态病原菌的防控起到积极的作用。通过细菌VBNC状态的综述进而对益生乳酸菌VBNC状态的研究提出新的思路,以解决乳酸菌发酵剂工业化生产中所面临的问题。

环境微生物可培养性影响因素及培养方法研究进展

目前,已知并能利用的微生物只是自然界微生物很小的缩影,过低的可培养效率使人类在认识和利用微生物上处于瓶颈阶段。现综述了微生物活的非可培养状态及其检测方法,阐述了微生物可培养性的影响因素,探讨了提高微生物可培养效率的培养策略和方法进展,以期为提高微生物的可培养性和菌种资源开发提供依据。

绿色荧光蛋白标记的嗜水气单胞菌在越冬水体的饥饿存活及复苏

将绿色荧光蛋白标记的嗜水气单胞菌 (Ah4332 GFP)置模拟越冬水体 ( 8— 1 0℃ )内 ,进行饥饿存活试验 ,用三种计数方法检查水体中的细菌数量变化。在 41d后平板计数法 (PC)降至0 ,而细菌总数法 (DC)和活菌直接计数法 (DVC)结果相似 ,只是DVC计数结果低于细菌总数1— 2个数量级。显示细菌已经变成活的非可培养 (Viablebutnonculturable ,VBNC)状态。复苏试验表明 ,升高温度、添加鱼血清或新鲜培养的Ah4332 GFP细菌上清及通过兔肠管结扎 ,均使VBNC状态的Ah4332 GFP得到复苏。荧光显微镜和电镜观察处于可培养和VBNC状态的Ah4332 GFP,后者的细菌细胞比前者体积明显缩小 ,形态由杆状变成了球形 ,但细胞膜和细胞壁是完整的 ,不是细菌L型。

大肠杆菌O157:H7的活的非可培养状态

将大肠杆菌 O157:H7培养于低温贫养条件下 ,以涂布平板法 (PC)和最大近似值法(MPN)检测可培养细菌数 ,95～ 115d后表明可培养菌数下降为零。吖啶橙荧光显微镜直接计数法(AODC)检测细菌总数 ,表明细菌总数始终变化不大 ,而活菌直接镜检计数 (DVC)检测到的活菌数保持在 10 6个 / m L。实验证明了大肠杆菌 O157:H7在一定的条件下可进入活的非可培养状态(VBNC)。

乳酸菌活的非可培养态的研究进展

乳酸菌在某些恶劣的环境下仍可以保持代谢活性,会失去在常规培养基上生长繁殖的能力从而进入活的非可培养态(Viable but non-culturable,VBNC)。文中阐述了目前已经发现的VBNC态乳酸菌的种类、其诱导和复苏条件、生理生化特性、检测方法及前景展望,使我们更深入地认识和了解乳酸菌的VBNC态,为今后乳酸菌在工业生产和应用过程中保持高活性状态提供新思路和新方法。

德氏乳杆菌保加利亚亚种ND02活的非可培养态诱导和复苏

为有效提高乳酸菌发酵剂菌种在生产和应用过程中的活性,对一株具有优良发酵特性的德氏乳杆菌保加利亚亚种ND02(保加利亚乳杆菌ND02)进行了活的非可培养(viable but non-culturable,VBNC)态诱导和复苏的初步研究。将活化的保加利亚乳杆菌ND02在不同复合条件下进行诱导,同时采用平板计数法和荧光显微镜两种计数方法对其进行检测,将诱导成功的样本通过改变温度及改变培养基成分进行复苏实验。结果表明:保加利亚乳杆菌ND02在液体MRS中4℃诱导190 d便可以进入VBNC态,并发现10%脱脂乳+0.1%酵母粉是有效的复苏方法。为保加利亚乳杆菌ND02在应用过程中避免VBNC态的产生及活性的提高提供一定的参考依据。

空肠弯曲菌在环境压力条件下的生存机制和可培养性研究进展

空肠弯曲菌是一种重要的革兰氏阴性致病菌,可以产生几种肠毒素能侵袭小肠和大肠黏膜引起急性肠炎,据统计其导致肠炎比例是沙门氏菌的3倍。该菌污染肉类食品后,经冷冻等环境的变化会进入活的非可培养状态(viable but non-culturable state,VBNC),不能用常规方法检测到。空肠弯曲菌在pH值、湿度、温度、营养成分等条件发生极端改变的情况下可以进入VBNC状态。本研究更深入地了解空肠弯曲菌是如何抵御外力影响的,防范食品安全的潜在危害。

牛奶发酵过程中阪崎克罗诺杆菌可形成活的非可培养状态

该研究以保加利亚乳杆菌为牛奶发酵剂,研究了牛奶发酵过程中阪崎克罗诺杆菌与保加利亚乳杆菌的相互作用以及阪崎克罗诺杆菌存活量的变化情况,并结合16S rDNA高通量测序技术和PMA-qPCR方法分析阪崎克罗诺杆菌在牛奶发酵过程中是否形成“活的非可培养”状态。结果显示,保加利亚乳杆菌在牛奶中发酵48 h后pH值可达到3.40,酸度值可达212.00。在发酵前期接种阪崎克罗诺杆菌,48 h后pH值和酸度值分别为3.50和193.30;在发酵中期接种阪崎克罗诺杆菌,48 h后pH值和酸度值分别为3.47和214.30。发酵前期阪崎克罗诺杆菌的污染对保加利亚乳杆菌发酵结果的影响更大。阪崎克罗诺杆菌在牛奶中生长48 h后菌浓度可稳定在9.08 lg(CFU/mL);不论在牛奶经发酵前期或中期接种阪崎克罗诺杆菌,发酵后期平板计数法均检测不到阪崎克罗诺杆菌,但16s rDNA和PMA-qPCR技术均可检测到阪崎克罗诺杆菌活菌的存在。该研究结果说明,阪崎克罗诺杆菌在牛奶发酵后进入了“活的非可培养”状态,该状态的存在会导致该菌检测时活菌数量的低估,从而引发乳及乳制品的安全隐患。