HIV-1 vif基因的RNA干扰体外研究

目的利用RNAi技术对HIV-1 vif基因的转录后水平进行下调,达到抑制vif蛋白表达的目的,为新的抗HIV治疗和预防研究提供理论基础。方法通过体外转录法合成siRNA,与转接有vif基因的表达质粒共同转染HEK293T细胞,荧光显微镜下观察干扰效果,并利用Real-time PCR和Western blot对HIV-1 vif分别从转录和表达水平进行验证。结果将pEGFP-N1-vif重组载体转染HEK 293T细胞后,结果显示vif蛋白可以在细胞中高水平表达;针对vif设计的3段特异的siRNA可以有效且特异地降低vif蛋白的表达。结论RNAi技术可以下调HIV-1蛋白的表达,此技术可以作为一项新的治疗和预防HIV-1的方法用于进一步的研究。

HIV-1 vif基因人工miRNA的构建和功能分析

目的构建人工miR-vif,并研究其对HIV-1感染宿主细胞的影响。方法以miR-155为基础骨架,根据HIV-1vif基因序列设计并合成4对miRNA寡聚单链DNA,构建4个人工miR-vif。采用qPCR技术检测其对vif基因的沉默效率和对干扰素表达的影响;MTT法测定其对被转染细胞的毒性;HIV-1假病毒实验技术检测其对感染的抑制作用。结果 qPCR结果显示,4个人工miR-vif对vif基因都具有一定的沉默效果,其中miR-vif-1的沉默效率最高,达68%。且不会对细胞干扰素的表达产生影响。MTT实验证实miR-vif-1不会影响被转染细胞的活性,此外,HIV-1假病毒实验显示,miR-vif-1对HIV-1p24的抑制作用达66.5%,效果明显。结论所获得的miR-vif-1对HIV-1的复制具有良好的抑制作用,可为进一步的抗HIV-1感染研究提供基础。

我国HIV-1 B'亚型流行株vif基因序列特征及变异分析

目的研究人免疫缺陷病毒-1(HIV-1)B'亚型vif基因的变异特征,探讨其与HIV传播和致病性之间的关系。方法采集河南省部分HIV感染者的外周血,提取41例HIV感染者外周血淋巴细胞DNA,设计特异性引物扩增其前病毒基因组中的vif基因,对于扩增阳性的29例PCR产物进行vif区基因的测序及分析。结果29条vif基因的平均离散率是0．0328,突变主要集中于90～120、270 -302、372～405、450～470四个区域。Vif多肽链的90～93位和157～160位存在两个富含R和K带有强烈正电荷的亲水区,带正电荷的R或K交替出现,几乎没有其他的氨基酸残基。29个Vif多肽链有21条在90～93位存在R90 RKR93基序;有26条在157-160位存在K157 RRK160基序,29条序列在114位和133位存在两个在HIV-1和HIV-2以及SIV内保守的半胱氨酸(A)。结论vif在HIV-1基因组内具有相对保守性,其特征性区域和氨基酸基序对于保持Vif蛋白的功能是十分重要的。

HIV-1始祖病毒Vpu和Vif拮抗宿主限制因子的能力

目的研究始祖病毒的生物学和早期进化特征,有助于阐明HIV-1建立感染的关键因素。方法以过表达的方法比较了始祖病毒和同一亚型的慢性感染病毒Vpu蛋白降解宿主限制因子BST-2的能力,利用流式细胞术检测两者对内源性BST-2细胞表面水平的影响。利用已构建的含荧光素酶报告基因的单循环感染始祖病毒表达质粒,比较了始祖病毒与同一亚型的慢性感染株下调BST-2的能力。用过表达的方法检测了Vif蛋白拮抗宿主限制因子h A3G的能力。结果对过表达以及细胞表面内源性BST-2,始祖病毒Vpu蛋白降解宿主限制因子BST-2的能力均显著高于同一亚型的慢性感染病毒。但在始祖病毒拮抗BST-2抗病毒活性的能力分析中,尽管始祖病毒Vpu表现出较强的下调BST-2的能力,仍然不足以拮抗外源过量表达的BST-2的抗病毒活性。在Vif降解hA 3G的实验中,始祖病毒Vif降解h A3G的能力弱于慢性感染病毒p MJ4或与之类似。结论始祖病毒具有更高的拮抗宿主天然免疫的能力,有助于其建立早期感染。

人APOBEC3H hap Ⅱ在昆虫表达系统中的表达及其纯化

目的构建重组人APOBEC3H hapⅡ(A3H hapⅡ)杆状病毒表达载体,在昆虫细胞表达系统中表达,表达产物经Ni-NTA亲和层析柱纯化。方法采用PCR方法扩增A3H hapⅡ基因并加入His标签后,克隆至杆状病毒转移载体p Fast Bac1中,转化E.coli DH10Bac感受态细胞进行重组,构建质粒Bacmid-A3H hapⅡ-His。将质粒转染昆虫细胞sf9获得P1病毒,扩增后获得P3病毒,感染sf9细胞表达目的蛋白,并进行Western blot鉴定。经Ni-NAT树脂亲和层析柱对表达的蛋白进行纯化,并通过免疫共沉淀试验检测A3H hapⅡ-His与其相互作用蛋白HIV-1 Vif之间的特异性结合。结果成功构建了质粒Bacmid-A3H hapⅡ-His;P3病毒感染sf9细胞后成功表达出相对分子质量约20 000的目的蛋白,且能够与HIV-1 Vif特异性结合。结论成功建立A3H hapⅡ昆虫表达体系,为进一步研究A3H hapⅡ与HIV-1 Vif之间的相互作用机制,并针对其相互作用位点设计抗HIV药物奠定了基础。