氯乙烯诱导小鼠胚胎神经管发育畸形的研究

目的观察孕早期不同剂量氯乙烯(VC)染毒后胎鼠神经系统发育以及神经上皮细胞增殖和凋亡的变化情况,明确VC对神经系统发育的致畸作用。方法将孕鼠21只按完全随机设计分组法分为实验组和对照组,实验组分别用不同剂量的VC对孕6.5 d的小鼠进行腹腔染毒,对照组注射花生油,均于E12.5取胚胎。观察胎鼠的表观发育情况,计算胚胎畸形率以及神经系统异常的发生率。运用PCNA免疫组织化学技术和TUNEL染色技术检测并观察神经管上皮细胞的增殖及其凋亡的变化。结果①中剂量VC组胎鼠活胎率下降,活胎中畸胎发生率高达51%,其中神经管畸形发生率占40%,与正常对照组相比差异有统计学意义(P<0.05);高剂量VC组胎鼠活胎率仅占55%,活胎中畸胎率明显增高占71%,其中神经管畸形发生率占50%,与正常对照组相比差异有统计学意义(P<0.01)。②中剂量和高剂量VC组胚胎神经管上皮厚薄不一致;高剂量组神经管多数呈明显未闭合状,神经管周围的间充质细胞肿胀,轮廓不清。③正常小鼠神经管神经上皮内可见PCNA阳性细胞与TUNEL阳性细胞分布;实验组各型阳性细胞分布与对照组相似,但随着染毒剂量的增加,PCNA阳性细胞表达减少,而TUNEL阳性细胞表达增多。结论孕早期一定剂量氯乙烯染毒可导致胚胎畸形率升高,神经管畸形率也相应上升。氯乙烯主要可抑制神经上皮细胞的增殖,诱导细胞凋亡发生增多,导致增殖与凋亡比例失调。

环磷酰胺对发育中大鼠神经上皮细胞增殖和凋亡的影响

目的:研究环磷酰胺对发育中大鼠神经上皮细胞增殖和凋亡的影响,进一步探讨其致畸作用的分子机制,为预防人类神经管畸形(NTDs)的发生提供理论依据。方法:将孕鼠随机分实验组和对照组,应用免疫组织化学技术检测增殖细胞核抗原(PCNA)、Caspase-3在NTDs发生中的表达变化。结果:(1)PCNA免疫组织化学结果,给药后4、8h,实验组神经上皮细胞增殖指数与对照组相比,无显著差异;给药后12、24、48h,实验组与对照组相比,神经上皮细胞增殖指数显著降低。(2)Caspase-3免疫组织化学结果,给药后4、8h,实验组神经上皮细胞凋亡指数与对照组相比,差异均无统计学意义;给药后12、24、48h,实验组与对照组相比,神经上皮细胞凋亡指数显著增高。结论:环磷酰胺可抑制神经上皮细胞增殖,诱导细胞凋亡,导致增殖凋亡比例失衡是神经管畸形发生的重要途径之一。

PMX诱导神经管畸形及其对神经上皮细胞增殖和凋亡的影响

目的:用培美曲塞(pemetrexed,PMX)建立叶酸缺乏的神经管畸形(neural tube defect,NTD)动物模型,并探讨其对神经上皮细胞增殖和凋亡的影响。方法:应用不同剂量PMX(5、10、15、17.5、20和30 mg/kg)对C57BL/6孕鼠进行干预,筛选最佳造模剂量。采用磷酸化组蛋白H3(pH3免疫组化的方法以及TUNEL方法)观察胎鼠神经上皮增殖和凋亡情况。结果:随着PMX剂量的增加,小鼠胚胎的吸收胎和畸形率逐渐增加,其中17.5mg/kg体重组的NTD的发生率最高(30.6%),被筛选为最佳造模剂量。pH3免疫组化和TUNEL结果显示,与正常对照组相比,NTD小鼠胚胎神经上皮细胞增殖减少(P<0.05),凋亡增加(P<0.05)。结论:PMX能诱导NTD的发生,其机制可能是因为PMX阻断了叶酸代谢通路并导致神经上皮细胞的增殖抑制和过度凋亡。

RTX诱导神经管畸形动物模型的建立及机制研究

目的 :通过胸苷酸合成酶(thymidylate synthase,TS)特异性抑制剂———雷替曲塞(RTX)干预孕鼠,建立小鼠神经管畸形(neural tube defects,NTDs)模型,探讨细胞凋亡和增殖、DNA损伤在RTX诱导的NTDs发生中的作用。方法:将孕7.5 d C57BL/6J小鼠随机分为6组:1组为对照组,5组为RTX干预组。对照组腹腔注射0.9%Na Cl,RTX干预组分别腹腔注射不同剂量的RTX(5.0、10.0、11.5、13.5、15.0 mg/kg),孕11.5 d取胚胎并观察其发育情况。苏木精-伊红(HE)染色观察神经管闭合情况,放射性法测定TS活性,高效液相色谱检测胸苷酸(d TMP)及尿苷酸(d UMP)含量,Western blot分析复制蛋白A2(RPA2)、γ-H2AX和caspase-3表达,免疫组化检测细胞增殖。结果:RTX注射剂量为11.5 mg/kg时,NTDs发生率最高(30.56%);RTX干预后,TS活性较对照组显著降低,dUMP含量显著升高,dTMP含量显著下降;RTX建立的NTDs模型中,RPA2和γ-H2AX磷酸化水平显著升高;caspase-3表达量显著增加,细胞增殖显著减少。结论:通过RTX干预孕鼠可建立小鼠NTDs模型,dTMP合成障碍导致DNA损伤、细胞凋亡与增殖失调可能是NTDs发生的重要机制。

羟基脲诱导神经管畸形小鼠模型及与其他小鼠模型的比较研究

目的本研究拟通过干扰新的叶酸相关代谢-核苷三磷酸还原成相应的脱氧核苷三磷酸通路中的关键酶-核苷酸还原酶,诱导构建神经管畸形(NTDs)小鼠模型,并且与前期构建的NTDs小鼠模型进行比较。方法实验小鼠选用C57BL/6J小鼠,购自北京华阜康公司,雌鼠60只,雄鼠30只,小鼠年龄7~8周,体重18~20 g,常规饲养于SPF级动物房。小鼠饲养一周后,晚上18∶00按照雄雌(1∶2)进行合拢,早上分笼将有阴栓的小鼠标记为孕0.5 d(E 0.5)。按照随机分组的方法将小鼠分为6组。其中实验组5组,在神经管闭合前的孕7.5 d(E 7.5),给予5种剂量的羟基脲进行腹腔注射;正常对照组,采用0.9%的氯化钠水溶液注射。采用不同剂量的羟基脲(HU)腹腔注射C57BL/6J孕鼠,诱导构建最佳小鼠NTDs模型,筛选出HU的最佳造模剂量为NTDs组。利用Western blot方法和免疫组化方法观察神经上皮细胞增殖和凋亡的情况,与前期诱导的NTDs小鼠模型中的结果进行对比。结果HU可诱导出NTDs的小鼠模型,免疫组化检测结果显示,畸形胚胎中的PCNA的阳性细胞低于正常胚胎组;Caspase3的阳性细胞高于正常组(P<0.05)。PCNA蛋白在NTDs组中的表达水平明显低于正常对照组(P<0.05),Cleaved Caspase-3蛋白在NTDs组中的表达水平明显高于正常对照组(P<0.05),并且与前期诱导模型的结果一致。结论本研究通过干扰核苷酸还原酶,引起了神经管发育过程中细胞增殖和凋亡的失衡,从而诱导构建出NTDs小鼠模型,为进一步研究NTDs的机制提供了新的动物模型。

甲氨蝶呤对早期神经胚基因表达的影响

目的:利用甲氨蝶呤(methotrexate,MTX)干预孕鼠,探讨MTX对早期神经胚基因表达的影响。方法:用MTX(4.5 mg/kg体重)干预孕鼠,通过NimbleGene表达谱芯片、Real time-PCR及免疫组化等方法进行差异表达基因的筛选和验证。结果:MTX处理后神经管畸形(NTDs)发生率为32.1%。表达谱芯片筛选出166个差异表达基因,其中4个凋亡相关基因(Endog,Trp53,Casp3,Bax)均表现为上调(fold change>1.5,P<0.05),3个增殖相关基因(Ptch1,Pla2g4a,Foxg1)均表现为下调(fold change<0.67,P<0.05);NTDs胚胎神经上皮Caspase-3表达显著升高(P<0.05),phospho-histone H3(pH3)表达显著降低(P<0.05)。结论:MTX影响了早期神经胚的基因表达,尤其是引起了凋亡、增殖相关基因表达的异常,这可能在叶酸缺乏引起NTDs发生的相关机制之一。

5-碘代杀结核菌素对小鼠神经管的影响及其作用机制

目的探讨腺苷激酶(adenosine kinase,ADK)抑制剂5-碘代杀结核菌素(5-iodotubercidin,ITU)对小鼠神经管的影响及其作用机制。方法将妊娠7.5 d的C57BL/6J小鼠随机分为ITU组(经腹腔分别注射2、3、4、5、6、7 mg/kg的ITU)和对照组(经腹腔注射含2%DMSO的生理盐水),妊娠11.5 d时,取胚胎,观察其发育情况。取对照组及神经管缺陷(neural tube defect,NTD)组(最佳剂量ITU)胚胎进行HE染色,观察小鼠神经管发育情况;ELISA法检测NTD组孕鼠血清中腺苷、AMP、S-腺苷同型半胱氨酸(S-adenosylhomocysteine,SAH)、S-腺苷甲硫氨酸(S-adenosylmethionine,SAM)水平;N6-甲基腺苷(N6-methyladenosine,m6A)甲基化检测试剂盒检测两组小鼠胚胎脑组织中m6A含量;EdU及TUNEL法分别检测两组小鼠胚胎脑组织中上皮细胞增殖及凋亡情况;Western blot法检测m6A相关酶蛋白(METTL3、FTO、YTHDF2)、细胞增殖相关蛋白(PCNA)及细胞凋亡相关蛋白(caspase-3)的相对表达水平。结果对照组胚胎生长发育良好,未出现NTD;ITU组随着剂量的增加,NTD的发生率逐渐增加,剂量为5 mg/kg时,小鼠NTD的发生率最高(32.2%),确定该剂量为建立NTD模型的最佳ITU剂量。对照组胚胎神经管发育良好,管腔规则,神经管闭合完全;NTD组胚胎神经管管壁厚薄不一,管腔不规则,神经管未完全闭合。NTD组孕鼠血清中腺苷、SAM、SAH的含量于注射后8 h显著增加(P<0.01),AMP含量显著下降(P<0.05)。与对照组比较,NTD组小鼠胚胎脑组织m6A含量降低,METTL3的相对表达量明显减少(P<0.05),FTO、YTHDF2的相对表达量无明显变化(P>0.05);PCNA的相对表达量明显减少(P<0.05),caspase-3的相对表达量明显增加(P<0.05),表明小鼠胚胎脑组织中上皮细胞增殖减弱,细胞凋亡增加。结论ITU可诱导小鼠NTD的发生,其作用机制可能与m6A含量降低导致神经上皮细胞增殖和凋亡紊乱相关。

五子衍宗丸对神经管畸形细胞模型凋亡途径的影响

目的探讨五子衍宗丸防治神经管畸形(NTDs)的可能作用机制。方法 PC12细胞随机分为空白组、模型组及五子衍宗丸低、中、高剂量组。除空白组外,其余各组采用全反式维甲酸(atRA)干预PC12细胞构建NTDs模型。五子衍宗丸低、中、高剂量组分别给予含五子衍宗丸的RPMI-1640培养基并使其最终浓度分别为125、250、500μg/ml进行预处理,模型组和空白组加入RPMI-1640培养基。测定各组PC12细胞活力及细胞凋亡率,并提取空白组、模型组及经细胞活力、细胞凋亡率实验确定的最佳剂量五子衍宗丸组细胞总RNA测序,筛选差异表达基因,运用维恩图得到目的差异表达基因集,并进行GO功能和KEGG通路显著性富集分析,对与细胞凋亡相关的差异基因进行共表达网络分析。结果模型组PC12细胞活力显著下降,细胞凋亡率显著增加,五子衍宗丸各剂量组细胞活力增强、细胞凋亡率降低,且以五子衍宗丸低剂量组效果最佳(P<0.05或P<0.01)。目的差异表达基因集GO功能分析显著富集到内质网应激介导细胞凋亡相关和细胞增殖生长相关的GO条目,KEGG通路分析显著富集到细胞生长和死亡相关的信号通路。与模型组比较,五子衍宗丸低剂量组内质网应激相关基因Em1、Casp12、Creb3l1下调,抗凋亡基因Birc5上调,与模型组较空白组这些基因上下调方向正好相反。结论五子衍宗丸可抑制细胞凋亡,保护神经元样细胞,其机制与调控内质网应激相关的基因表达,与染色体分离、细胞核分裂、细胞周期等细胞增殖、生长和死亡等生物过程或信号通路相关。