山东地区1株牛病毒性腹泻病毒的分离鉴定及遗传进化分析

【目的】了解并掌握山东地区牛病毒性腹泻病毒(Bovine viral diarrhea virus,BVDV)流行毒株的生物学特性和遗传变异情况,为BVDV防控提供理论依据和技术支持。【方法】采集养牛场疑似BVDV感染样品制备组织上清液,利用RT-PCR方法进行病原鉴定,接种MDBK细胞进行病毒分离培养,采用间接免疫荧光试验(IFA)和电镜观察对分离毒株进行鉴定,对分离毒株全基因组进行分段扩增、克隆和测序,并采用Lasergene等软件分别对全基因组序列、N^(pro)和E2基因进行比对和遗传演化分析。【结果】病料样品BVDV特异性引物RT-PCR扩增得到大小约504 bp的目的条带,与预期大小一致。IFA结果显示特异性绿色荧光;电镜下可见直径约50 nm的病毒粒子,表明分离到1株非致细胞病变型BVDV毒株,命名为SDNF9株。分离株基因组全长为12232 nt,与BVDV参考毒株的全基因组核苷酸相似性为79.1%~93.8%,其中,与中国分离毒株22AH-1和澳大利亚毒株Bega-like的相似性最高,为93.8%;N^(pro)和E2蛋白氨基酸存在多个位点变异;SDNF9分离毒株与BVDV2型毒株和BVDV3型毒株处于遗传演化的不同分支,而与BVDV 1型毒株处于同一分支,属于BVDV 1c基因型。【结论】本研究成功分离到1株BVDV 1c流行毒株,并进行基因组和遗传演化分析,与中国分离毒株22AH-1亲缘关系最近,为山东地区牛病毒性腹泻的防控和疫苗研制提供数据和材料支持。

1株进口胎牛血清源牛病毒性腹泻病毒的分离鉴定及小鼠致病性分析

【目的】对进口胎牛血清中的牛病毒性腹泻病毒(Bovine viral diarrhea virus,BVDV)进行分离鉴定和遗传进化分析。【方法】通过RT-PCR方法检测到实验室购买的某进口胎牛血清中存在BVDV核酸污染,将污染血清接种MDBK细胞,传代培养至第7代,对每一代细胞的培养物进行BVDV 5′-UTR扩增,PCR扩增产物连接pMD19-T载体并测序,对测序结果进行遗传进化分析;利用间接免疫荧光试验(IFA)进行分离株抗原检测和病毒滴度测定;将分离株接种BALB/c小鼠,采集眼眶血进行血常规检测和RT-PCR检测。【结果】该病毒分离株在培养MDBK细胞时未能引起细胞病变效应,细胞培养物RT-PCR扩增为阳性;基于5′-UTR序列的相似性分析表明,该分离株与BVDV UDEC-COY7-17(OL860952.1)毒株5′-UTR序列相似性为99.6%,同属BVDV-1e亚型;IFA检测到感染分离株的MDBK细胞细胞质中出现特异性绿色荧光信号,而对照组无信号;半数培养感染剂量(50%tissue culture infectivedose,TCID 50)为10-4.7/0.1 mL;接种BALB/c小鼠后第7天血常规检测其血液中白细胞(WBC)和淋巴细胞(LYM)数量极显著低于对照组(P<0.01)。提取血液总RNA进行5′-UTR RT-PCR检测,检测结果为阳性,扩增产物大小为298 bp,与预期相符。【结论】本研究在进口胎牛血清中分离得到1株非致细胞病变型BVDV-1e亚型毒株,证明进口胎牛血清中存在BVDV抗原污染,为进一步研究BVDV的相关分子机制提供试验材料。

平凉地区肉牛腹泻源病毒性腹泻病毒的分离鉴定

为分离与鉴定平凉地区肉牛腹泻源病毒,采集5份甘肃省平凉地区某大型规模化肉牛养殖场内疑似感染BVDV的肉牛粪便作为研究病料,经MDBK细胞接种分离病毒、病毒含量测定、琼脂扩散试验、RT-PCR、动物回归试验对病毒进行分离与鉴定。结果可见,共分离获得2株BVDV,TCID_(50)值分别为10^(-5.88)/0.1 mL、10^(-5.61)/0.1 mL;这2株病毒经RT-PCR可特异性扩增出1条大小为804 bp的目标电泳条带,与BVDV Oregon C24标准阳性血清的琼脂扩散试验能够产生明显的沉淀线,且与BVDV标准抗原形成的沉淀线相连;接种分离获得的2株病毒至动物体内,可表现出典型的BCVD临床症状。该研究成功从平凉地区肉牛养殖场内分离鉴定出2株BVDV毒株,且毒株的致病性较强,与标准毒株的抗原性相同,可导致肉牛产生典型临床症状。

An Improved Culture System for Virus Isolation and Detection

Cell culture plays an important role in virology. It provides a platform for the detection and isolation of viruses as well as for the biochemistry and molecular biology based studies of viruses. In the present work, a new system that could permits multiple (different) cell lines to be simultaneously cultured in one dish was developed. In the system, each cell line was cultured in an isolated zone in the same dish or well and the system is therefore called an isolated co-culture system. The usefulness of this novel approach for virus isolation was demonstrated using a model system based on adenovirus.

猪圆环病毒3型的分离及致病性分析

猪圆环病毒3型(porcine circovirus type 3,PCV3)是2016年由美国首次报道引起母猪繁殖障碍的一种新型猪圆环病毒,该病毒的致病性尚不完全清楚。为研究PCV3对断奶仔猪的致病性,本研究用PK-15细胞自临床病料分离到1株PCV3毒株,命名为PCV3/CH/HB/XY/2018,全基因组测序分析表明,该毒株属于PCV3a-IM基因亚型。分别用PCV3阳性病料初始匀浆液和第8代细胞培养物采用滴鼻和肌肉注射2种方式感染28日龄断奶仔猪,每组试验猪5头,并设置空白对照组。通过观察和分析试验猪的临床表现、体温、增重、病毒血症、各组织的病毒载量和病理变化等方面评价仔猪感染试验结果。结果显示:PCV3阳性病料初始匀浆液和细胞培养物在感染断奶仔猪后均会引起仔猪出现体温上升、消瘦、皮炎和生长缓慢等现象;病毒血症时间超过14 d,但21 d消失,病毒的组织分布结果表明,PCV3主要感染扁桃体、淋巴结等免疫器官,在脾、肺和扁桃体等组织中的病毒载量最高;感染猪可出现间质性肺炎、淋巴小结增生和嗜酸性粒细胞增多等病理变化。本研究表明PCV3/CH/HB/XY/2018毒株对断奶仔猪有致病性,为PCV3的致病机制研究奠定了基础。

川东北地区腹泻牛群中牛病毒性腹泻病毒的分子流行病学调查及病毒分离鉴定

为了掌握川东北地区腹泻牛群中牛病毒性腹泻病毒(BVDV)的感染情况和主要流行基因型及亚型,采用RT-PCR方法对采集于川东北地区临床腹泻牛粪便样品进行了病原学检测。根据5'-UTR基因序列进行遗传变异分析和基因分型鉴定,并对RT-PCR阳性样品进行了病毒的分离鉴定。结果显示:97份腹泻样品中BVDV平均阳性感染率为9.28%,达州市的阳性率最高(13.04%)、巴中市的阳性率最低(5.26%)。在5'-UTR基因系统进化树中9份阳性样品均为BVDV-1型,包括BVDV-1a(n=2)和BVDV-1b(n=7),经细胞培养、RT-PCR检测、间接免疫荧光检测共分离鉴定出2株致细胞病变型BVDV。表明川东北地区腹泻牛群中均存在BVDV感染,流行的优势基因亚型为BVDV-1b,丰富了BVDV的分子流行病学资料,为川东北地区BVDV的综合防控提供了理论基础。

朱砂七化学成分及其体外细胞毒性、抗病毒活性研究

目的研究朱砂七Fallopia multiflora var.ciliinervis(Nakai)Yonekura&H.Ohashi化学成分及其体外细胞毒性、抗病毒活性。方法朱砂七75%乙醇提取物采用硅胶柱层析、半制备HPLC进行分离纯化,根据理化性质及波谱数据鉴定所得化合物的结构。采用MTT法测定体外细胞毒活性,CCK-8法测定体外抗病毒活性。结果从中分离得到20个化合物,分别鉴定为3-acetyl-4,5-dimethoxy-benzoic acid(1)、没食子酸甲酯(2)、没食子酸(3)、对羟基苯甲醛(4)、原儿茶酸(5)、3,4-二羟基苯甲醛(6)、丁香酸(7)、4-羟基-3-甲氧基苯甲酸(8)、p-hydroxyphenethyl-O-β-D-glucoside(9)、2-(4-hydroxy-3-methoxyphenyl)-ethyl-O-β-D-glucoside(10)、反式-白藜芦醇(11)、顺式-白藜芦醇(12)、白藜芦醇-3-O-β-D-(2′-O-反式-肉桂酰基)-葡萄糖苷(13)、白藜芦醇-3-O-β-D-(2′-O-顺式-肉桂酰基)-葡萄糖苷(14)、白藜芦醇-3-O-β-D-葡萄糖苷(15)、N-反式阿魏酰-3-甲氧基酪胺(16)、poke-weed cerebroside(17)、何首乌乙素(18)、9,10,13-三羟基十八烷酸(19)、正丁基-β-D-吡喃果糖苷(20)。化合物11对HCT116、SW620细胞的IC 50值分别为(30.87±2.7)、(56.11±0.49)μmol/L,化合物12对EV-A71病毒的抑制率为50.21%。结论化合物1为新天然产物,化合物9~10为首次从蓼科植物中分离得到,化合物8、12、14、17、19为首次从何首乌属植物中分离得到,化合物2、4~7、11、18为首次从该植物中分离得到。化合物11具有细胞毒性,化合物12具有抗病毒活性。

1株牛病毒性腹泻病毒的分离鉴定及其结构蛋白E2序列分析

为了解河北省唐山市规模化奶牛场中牛病毒性腹泻病毒(BVDV)流行毒株的基因特征,本试验于唐山市2个规模化奶牛场采集了49份临床样品进行逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)检测,并对阳性样品进行病毒的分离,最终成功分离到1株非致细胞病变的BVDV毒株,命名为HB-1株。电镜观察结果显示,HB-1株具有典型的BVDV病毒粒子形态。对HB-1株全基因组序列进行扩增和测序,基因遗传进化分析结果显示,HB-1株属于BVDV-1m亚型。HB-1株结构蛋白E2全长序列糖基化位点和抗原表位预测结果显示,HB-1株E2蛋白含有4个保守的糖基化位点,其中抗原表位1高度保守。本试验为河北省进一步开展牛病毒性腹泻(BVD)流行病学调查、疫苗株筛选以及检测方法建立提供数据支撑。

牛病毒性腹泻病毒LN-1株的分离鉴定及基因组序列分析

【目的】查明并掌握辽宁地区牛病毒性腹泻病毒(Bovine viral diarrhea virus,BVDV)的流行特性及生物学特点,为BVDV的防治提供理论基础和技术支持。【方法】采集辽宁省某养牛场疑似发生BVDV感染的病死牛脾脏组织,用牛传染性鼻气管炎病毒(Infectious bovine rhinotracheitis virus,IBRV)、牛呼吸道合胞体病毒(Bovine respiratory syncytial virus,BRSV)、牛副流感病毒3型(Bovine parainfluenza virus type 3,BPIV3)及BVDV基因特异性引物进行RT-PCR鉴定,将组织液接种MDBK细胞分离病毒。对细胞进行细胞病变效应(CPE)观察后再通过电镜观察、间接免疫荧光试验(IFA)鉴定病毒,PCR扩增病毒全基因组序列并对其进行遗传进化分析。【结果】BVDV特异性引物RT-PCR鉴定结果为阳性,在280 bp处有条带,与预期条带大小相符,其余病原特异性引物未扩增出条带,证明未感染其他病原;分离得到的毒株在MDBK细胞中培养未出现明显细胞病变效应;病毒纯化后,经电镜观察可见直径约为50 nm的病毒粒子;免疫荧光试验结果显示,在接种分离毒株的MDBK细胞内可观察到亮绿色荧光,而对照细胞没有荧光,将分离得到的病毒命名为LN-1株;全基因组扩增序列大小为12269 bp,遗传进化分析发现,LN-1株与XC、SD-15及ZM-95株在同一分支,与XC株核苷酸相似性为96.2%,属于BVDV-1m型。【结论】本研究成功分离出1株1m型BVDV毒株,对后续疫苗研发、流行病学调查及致病机理等方面研究具有重要意义。

宁夏地区1株牛病毒性腹泻病毒2a亚型毒株的分离鉴定

为了解宁夏地区牛病毒性腹泻病毒(BVDV)的分子流行病学现状及其Npro基因的遗传变异情况,从宁夏某牛场疑似感染BVDV的9份牛血清中分离到1株可导致细胞发生病变的BVDV毒株,命名为BVDV NX-01,通过测定病毒滴度、电镜观察、病毒N^(pro)基因扩增及测序、绘制进化树、序列一致性比对等方法,对分离株进行鉴定及遗传进化分析。结果:该分离株接种MDBK细胞培养可产生明显的细胞病变,培养48 h病毒滴度达10^(7.0)TCID_(50)/0.1 mL,病毒粒子呈有囊膜的球形,直径40~60 nm;进化分析结果表明,BVDV NX-01与GS2018株有较近的亲缘关系,同属于BVDV-2a基因亚型;序列一致性比对发现,BVDV NX-01与进化树中处于同一分支的GS2018株N^(pro)基因一致性高达98.9%,进一步说明分离株BVDV NX-01属于BVDV-2a亚型。本研究结果不仅丰富了宁夏地区BVDV的分子流行病学数据,也为从分子水平研究BVDV的致病机理提供一定的理论依据。

城市地铁修建与运营对古建筑的影响

针对城市地铁修建与运营对古建筑的影响问题,本文以西安地铁穿越大雁塔、钟楼与古城墙为例,阐述地铁选线、施工和运营阶段对古建筑的保护策略。施工阶段以地铁施工工法及技术手段的选择为主,运营阶段则以减小振源振动及隔振为主。最后,指出我国在地铁修建与运营对古建筑影响方面需要进一步研究的问题,为今后的地铁修建与运营和古建筑保护提供参考。

兔病毒性出血症病毒的分离和鉴定

本试验对山东某兔场疑似感染兔瘟致死的病料进行中和试验、血凝和血凝抑制试验、PCR鉴定及测序比对。试验结果表明,4份分离的病毒上清液都能与1%人O型红细胞发生凝集,凝集效价均为1:1024;与兔病毒性出血症阳性血清中和反应后,对人O型红细胞没有凝集反应;PCR扩增结果显示4份送检样品均在286 bp位置出现了目的条带,经测序比对,该序列与中国的03/China/2016毒株VP60基因(登入号为MF669712.1)序列同源性最高,相似度为99.65%。试验结果充分说明该病毒为兔病毒性出血症病毒,该兔场流行疫病为兔瘟。

牛病毒性腹泻病毒BVDV-JL株的分离与鉴定

本研究从吉林某牛场表现严重腹泻症状濒死牛的胸腺病料样品中分离一株病毒,该病毒在MDBK细胞中盲传4代无细胞病变产生,而通过RT-PCR和间接免疫荧光试验、微量血清中和试验检测表明该分离病毒株为牛病毒性腹泻病毒(BVDV),并命名为BVDV-JL。将BVDV-JL株F4代细胞培养液(107.13TCID50/mL)经鼻内喷雾人工感染3月龄～6月龄BVDV抗体阴性黄牛(6mL/头),感染牛表现连续两天体温升高,白细胞数量下降,并在感染牛的白细胞提取物及鼻拭子样品中分离到该病毒株,表明该病毒株具有致病性。BVDV-JL株的分离对进一步开展疫苗研发、流行病学调查以及致病机理等方面的研究具有重要意义。

1株猪源牛病毒性腹泻病毒的分离与鉴定

从BVDV阳性仔猪病料中分离病毒,为开展猪源BVDV病原学研究奠定基础。将处理后BVDV阳性仔猪组织样品接种MDBK细胞,分离到1株猪源BVDV,命名为SD0803株。通过细胞培养、直接免疫荧光、5′-UTR与Npro PCR扩增、电镜观察、TCID50测定及对其分子进化特征加以分析。结果表明,该毒株在MDBK细胞上盲传至13代未出现细胞病变。在直接免疫荧光试验中呈阳性荧光信号。PCR扩增分别获得5′-UTR与Npro预期大小DNA片段。电镜观察,病毒粒子略呈圆形,有囊膜,直径约50nm。病毒滴度为10-6.5 TCID50.0.2 mL-1。SD0803 5′-UTR、Npro序列进化分析显示,该分离株属于BVDV-1,与已知BVDV-1各亚型之间同源性较低,单独成一分支。结果表明,成功分离鉴定1株猪源BVDV SD0803,该毒株为非致病变型BVDV-1,极有可能为BVDV-1新的亚型。

牛病毒性腹泻病毒黑龙江分离株的分离鉴定

为分离牛病毒性腹泻病毒(BVDV)并分析其5'UTR序列和遗传特征,本研究于2010年对黑龙江某奶牛场采集的患有腹泻的牛病料样品进行病毒分离,通过理化特性试验及RT-PCR对两株分离株进行鉴定,并根据其5'UTR序列进行同源性分析。结果表明,两株分离株均能够产生典型的细胞空泡样细胞病变,对乙醚、氯仿、胰酶极其敏感,不耐热,Mg2+对其不具有保护力,对酸的抵抗力较弱;5'UTR序列分析显示两株分离株与BVDV-1b型5'UTR同源性较高。以上结果表明本研究分离获得的两株分离株为1b基因型的BVDV,为引起该牛群腹泻病的主要病原因素。本研究为BVDV感染机制和疫苗研制奠定了重要基础。

北京市朝阳区2005～2006年流感病原学监测分析

[目的]分析朝阳区2005~2006年度流感监测的病原学检测结果,及时掌握流感流行信息,为制定流感防制方案提供科学依据。[方法]对哨点医院和集体发热疫情进行监测采样,采用细胞培养法和鸡胚接种法分离流感病毒并进行分型鉴定。[结果]自2005年11月~2006年4月共采集流感样咽拭子标本204份,检出流感病毒106株,其中甲1型24株,乙型82株,阳性检出率分别为22.6%和77.4%;流感疫情共涉及到本区26家单位,其中从22所小学发热疫情中分离到流感病毒。流感细胞培养法和鸡胚双腔法的阳性分离率分别为51.96%（106/204）和7.55%（4/53）。[结论]引起本地区流感疫情的流感病毒为乙型和甲1型;流行高峰主要在2006年3~4月;流感病毒易发生变异,而导致在中小学生人群中流行并引起集体发热;细胞培养法较鸡胚接种法更灵敏、阳性分离率更高;应加强流感的全年监测。

犬副流感病毒的分离鉴定及部分基因序列分析

目的分离并鉴定犬副流感病毒（canine parainfluenza virus,CPIV）,并对该病毒N、HN和F基因进行序列分析,研究其遗传变异情况;为CPIV诊断、治疗以及预防奠定分子生物学基础。方法用Vero细胞接种感染CPIV阳性犬肺组织,盲传3代,观察病变情况,收集72 h培养液进行PCR鉴定、血凝特性以及形态学观察。同时,用3对特异性引物,扩增N、HN和F全基因,进行序列测定和分析,并制作系统进化树。结果从犬肺中成功分离出一株犬副流感病毒,并命名为QF20100726。该病毒能凝集豚鼠、猪、鸡和人O型血,电镜观察病毒呈圆形、长丝状等形态多样、大小不等的颗粒状;序列分析表明,与人源、犬源等10株有代表性的副流感病毒基因相比,N基因核苷酸同源性为95.7%~99.8%,氨基酸同源性为97.4%~99.6%,其中有两处氨基酸发生新的变异,分别是第257位由V变成了A,第301位由A变成了T;HN基因核苷酸同源性为95.5~99.8%,氨基酸同源性为96.3~99.6%,F基因核苷酸同源性为94.7%~99.6%,氨基酸同源性为95.6%~99.3%。有两处发生特异变异,分别是56位由T变成了S,89位由T变成了M。结论成功分离犬副流感病毒QF20100726分离株,其血凝特性及超微形态特征均符合CPIV特性,N、HN和F全基因生物进化树显示,该分离株与犬副流感病毒分离株08-1990（登录号：KC237063）亲缘关系最近;N基因氨基酸在第257位（由V变成了A）和第301位（由A变成了T）,F基因氨基酸在第56位（由T变成了S）和89位（由T变成了M）发生了特异性变异。这些数据将为CPIV的防控奠定基础。

牛病毒性腹泻-黏膜病诊断方法研究进展

牛病毒性腹泻-黏膜病是由黄病毒科、瘟病毒属的牛病毒性腹泻病毒引起的一种传染性疾病。该病以发热、黏膜糜烂、溃疡、白细胞减少、腹泻、怀孕母牛流产或产畸型胎儿为主要特征。该文就近几年来国内外对该病的实验室诊断方法,包括病毒分离、血清学试验、电镜观察、免疫荧光技术、聚合酶链反应技术等的研究概况进行了综述。

国内新型基因2型牛病毒性腹泻病毒研究进展

牛病毒性腹泻病毒(Bovine viral diarrhea virus,BVDV)有两种基因型:基因1型(BVDV-1)和基因2型(BVDV-2)。以往的流行病学调查显示BVDV-1的分布和流行区域更加广泛,但近年来国内BVDV-2的发病率呈持续升高趋势。BVDV-2通常会引起严重的急性感染和出血综合征,给养牛业造成巨大损失。本文就BVDV-2特异性检测方法和基因分型的建立,型特异性BVDV-2毒株的分离与鉴定,BVDV-2优势分离株的全基因组测定与遗传特性分析及BVDV-1和BVDV-2抗原和抗体检测平台的建立等方面展开简要综述。

牛病毒性腹泻病毒基因2型毒株的分离与鉴定

本研究采用特异性RT-PCR从某实验室送检MDBK细胞中分离到1株牛病毒性腹泻病毒(Bovine viral diarrhea virus,BVDV),命名为BVDV-C1。通过免疫荧光、电镜观察和5'UTR序列测定及分子进化分析,结果表明其在MDBK细胞中无细胞病变产生,应用牛病毒性腹泻病毒2型特异性单克隆抗体检测,在感染细胞胞浆内呈现特异性荧光信号,而牛病毒性腹泻病毒1型特异性单克隆抗体未检测到荧光。电镜观察病毒粒子呈圆形,有囊膜,直径约为50 nm。5'UTR序列分析表明该毒株属于BVDV-2b基因亚型。BVDV-C1株的分离对进一步开展疫苗研发、流行病学调查以及致病机理等方面的研究具有重要意义。