一种可用于OBI检测的高灵敏度核酸提取方法的建立与验证

目的 建立和验证1种可用于隐匿性HBV感染(OBI)检测的大体积高灵敏度核酸提取方法,并将其应用于低病毒载量OBI标本的定量检测。方法 参考罗氏核酸检测试剂盒核酸提取方法,建立1种大体积核酸提取方法。将HBV标准品分别配置成10 000 IU/mL、1 000 IU/mL、100 IU/mL、10 IU/mL和1 IU/mL浓度,采用磁珠法从10 mL相应浓度的标准品中提取核酸,采用荧光定量PCR法检测各浓度的CT值,每个浓度梯度进行平行双份检测,以病毒浓度的对数为X轴,2次检测CT值的平均值为Y轴,构建荧光定量标准曲线和回归方程。通过3次重复实验验证该方法的稳定性。应用本方法提取低病毒载量OBI标本核酸并进行荧光定量。结果 3次HBV病毒荧光定量标准曲线扩增效率(E)均在90%~105%,回归方程(R2)均>0.99。不同浓度标准品CT值的变异系数(CV)分别为0.63%、0.78%、1.52%、1.36%和0.78%。本方法可以提取出病毒载量低至1 IU/mL的OBI标本核酸并进行定量。结论 本方法HBV核酸定量检测系统检测下限可达1 IU/mL,并且具有较强稳定性和灵敏度,可用于低病毒载量OBI的定量检测。

三种核酸共提取试剂盒对血液病毒提取效能的比较研究

目的比较不同核酸共提取试剂盒对血液病毒的提取效能差异。方法选择国内外广泛使用的3种血液病毒核酸共提取试剂盒,分别为OMEGA试剂盒、QIAGEN试剂盒和WATSON试剂盒,HBV阳性、HBV阴性、HCV阳性和HCV阴性血清样本均取自南京军区南京总医院。样本核酸提取按照各试剂盒说明书进行操作,定量方法采用实时荧光定量PCR。结果 OMEGA试剂盒对DNA的提取效率最高,对RNA的提取效率最低,耗时最短,成本居中;QIAGEN试剂盒DNA和RNA提取效率均较高,耗时居中,成本最高;国产WATSON试剂盒对DNA或RNA提取效率居中,耗时最长,成本最低。结论不同试剂盒对血液病毒的提取效能各不相同。对于已知病毒载量和病毒种类的样本,根据提取液DNA浓度和RNA浓度选择试剂盒;而对于未知病毒载量和病毒种类的样本,首选QIAGEN试剂盒,其次可选WATSON试剂盒。如只考虑成本,则首选WATSON试剂盒。

3种从猪精液中提取病毒核酸方法的比较

试验分别以猪伪狂犬病病毒(PRV)和猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)作为猪DNA、RNA病毒的代表,通过添加法制备带毒精液,采用样品前处理联合试剂盒硅基质柱纯化法(简称柱纯化法)、优化TRIzol方法(简称TRIzol法)和国外文献方法(简称文献法)分别对带毒精液进行核酸提取,用实时荧光定量RT-PCR或PCR比较不同核酸提取方法的效率。结果显示,柱纯化法提取的病毒核酸的检测灵敏度达到最高,对PRRSV及PRV带毒自然精液、商品化稀释精液的检测低限分别可达1.26和0.13TCID50/mL。柱纯化法全程包括精液的前处理和核酸提取可在1h内完成,与文献法所用时间相当,比优化TRIzol法缩短0.5h。本试验优化了适用于从猪自然精液和商品化稀释精液中高效提取病毒核酸的方法。