烟草花叶病毒(TMV)免疫诱抗剂的制备与验证

为了制备烟草花叶病毒(TMV)免疫诱抗剂,研究采用壳寡糖、高锰酸钾、内生真菌发酵液、紫外线、银杏叶提取物等试剂处理,筛选出TMV弱毒/无毒株系制备的最优方法,并在室内开展免疫激活效应。结果表明:紫外线、0.1%高锰酸钾溶液、内生真菌发酵液16倍浓缩液、100μg/mL壳寡糖溶液对TMV表现出良好的钝化效果,钝化液对TMV有较高的抑制率。钝化TMV能引起烟草多酚氧化酶(PPO)、过氧化物酶(POD)、超氧化物歧化酶(SOD)、苯丙氨酸解氨酶(PAL)、过氧化氢酶(CAT)5种防御酶活性显著升高,从而提高烟株对TMV感染的抗性。烟苗和大田烟叶TMV防控试验也证明钝化TMV在烟叶生产中可以作为TMV免疫诱抗剂使用,提高烟株的TMV免疫力和抵抗力。

与辣椒抗TMV L^(3)基因连锁的分子标记的筛选及种质资源抗TMV鉴定

以含抗辣椒TMV的L^(3)基因的材料L15为基础,利用与L^(3)基因连锁的3个分子标记189D23MF、PMFR11和PMFR21对种质资源进行鉴定.对L15、3份感病材料H8/H9/H11×L15 F_(1)、46份辣椒种质资源进行室内人工TMV接种并对其进行表型抗性鉴定和RT-PCR检测.对筛选出的标记在F_(1)及BC_(1)P_(1)群体中进行验证.结果表明:分子标记189D23MF在L15和12份辣椒种质上均未扩增出条带;SCAR标记PMFR11在L15和46份辣椒种质上呈现共显性分离,SCAR标记PMFR21为显性标记.通过室内人工接种鉴定方式,2份材料L15、H11×L15表现为高抗.H9×L15表现为抗,H8×L15及5份材料A1、A35、A39、A55、L16表现为中抗,11份材料表现为感病,30份材料表现为高感.在F1及BC1P1群体中PCR扩增结果表明SCAR标记PMFR21可用于辣椒抗TMV分子标记辅助选择.

二氢卟吩铁对烟草TMV的防治效果和产质量的影响

为了探寻一种更有效且绿色环保的烟草花叶病毒病(Tobacco mosaic virus,TMV)防治方法,采用室内盆栽和大田试验相结合的方法,测定了0.02%二氢卟吩铁(Iron chlorin e6,ICE6)对TMV的防控效果和对烟草的促生作用。结果表明,ICE6对TMV防治效果随浓度的增加而增强,稀释5000倍液处理防效最好,室内和大田试验防效分别为73.20%和72.35%,且趋势一致。同时ICE6可显著提高叶片暗反应中的PSII最大光化学量子产量(F_(v)/F_(m))和PSII潜在活性(F_(v)/F_(o))值,5000倍稀释液处理较清水对照分别提高16.99%和46.62%。此外,ICE6对烟草株高、叶长、叶宽和单叶质量有明显的促进作用,施用后增产效果显著,产量和产值分别比对照组增加9.34%和21.35%;且烟碱、总氮、还原糖、总糖、钾、氯、糖碱比均有显著提升。表明ICE6可有效防治烟草TMV,且对烟草植株的生长和烟叶品质提升具有促进作用。

TMV、CMV和PVY三重荧光定量PCR同步检测方法的建立

为建立同时检测烟草普通花叶病毒(TMV)、黄瓜花叶病毒(CMV)和马铃薯Y病毒(PVY)的多重荧光定量PCR方法,本研究根据GenBank中TMV、CMV及PVY的CP基因保守序列设计引物和探针,并对反应体系进行了优化,建立了可同时检测TMV、CMV和PVY的三重荧光定量PCR方法,并评价了该方法的敏感性、特异性、重复性及准确性。结果显示,建立的方法中TMV、CMV和PVY的检测下限分别为2.60×10^(1)、1.25×10^(1)、2.33×10^(1) copies/µL,检测灵敏度比普通PCR法提高10倍;该方法可特异性检测出TMV、CMV和PVY,但烟草蚀纹病毒(TEV)、烟草脉带花叶病毒(TVBMV)和番茄斑萎病毒(TSWV)无法检出且无交叉反应,批内与批间重复性试验变异系数均小于1.5%,24份样本检测结果中TMV、CMV和PVY的阳性检出率分别为75%、100%和41.67%,且三重荧光定量PCR方法与普通单重PCR方法得出一致的检测结果。结果表明本研究建立的三重荧光定量PCR检测方法具有特异性强、稳定性好、准确性高等优点,可为后续TMV、CMV和PVY的病害诊断与流行调查提供技术支持。

嵌入TMV转接板的扇出型三维封装集成技术研究

本文研究了一种嵌入TMV转接板的晶圆级扇出型封装技术,并成功应用于三维封装集成中。该技术首先通过热机械仿真对重构晶圆的翘曲及封装体的应力分布情况进行模拟;之后通过机械打孔、电镀等工艺制备尺寸、阵列数量均可定制化设计的独立TMV转接板。将TMV转接板与芯片通过晶圆级封装中的塑封、减薄、再布线、BGA植球等工艺制备具有双面再布线的封装体;然后通过倒装回流焊工艺将不同封装体的焊球与焊盘互相连接构筑三维集成封装体,以进一步拓展在三维集成中的应用,SEM图像和通断测试结果说明上述封装体具备良好的互连特性;最后对三维集成封装体进行了可靠性测试,优良的电性能结果表明封装体具备高可靠性。三维集成封装工艺的开发和可靠性试验表明嵌入TMV转接板的三维封装集成工艺稳定可靠,为三维集成提供了新的解决方案。

几种植物提取液对TMV体外活性及烟草叶片超微结构的影响

【目的】烟草普通花叶病毒病(TMV)是对烟叶产量和质量影响严重的一种病害。本研究为利用环保型植物源制剂防治烟草花叶病毒病提供理论依据。【方法】分别用水煎煮和乙醇浸提2种方法提取白花蛇舌草、莲叶和配伍多种植物的提取液。取等体积的植物提取液与烟草花叶病毒混合,观察TMV粒体形态及体外钝化效果,将提取液喷施感染TMV的烟叶上,观察烟草叶片超微结构的变化,并进行大田试验。【结果】正常的TMV粒体呈刚直、杆状,植物提取液与TMV等体积混合后,由于提取液的种类和作用时间不同,TMV粒子有不同程度的破坏、断裂或凝聚,感染TMV叶片细胞中存在大量杆状病毒粒子及其垛叠成的结晶体,叶绿体肿胀,外膜破裂,基粒片层紊乱、解体,细胞器消失,细胞空泡化。经植物提取液处理后,上述症状明显减轻。植物提取液对TMV的体外钝化效果分别为:白花蛇舌草50.77%—60.61%、莲叶73.39%—85.19%、制剂91.30%—92.13%,制剂比其它2种效果明显,大田试验验证制剂防治效果达71.02%—81.92%。【结论】植物提取液对TMV粒体有明显的破坏作用,因而能减轻TMV对烟草的危害。

15种植物的单宁提取物对烟草花叶病毒(TMV)的抑制作用

测定了 15种植物的乙醇粗提物对TMV的体外抑制作用 ,其中 11种具有明显效果 ,这 11种植物粗提物经水 /氯仿萃取 ,水萃取物具有明显抑制TMV效果 ,而氯仿萃取物抑制效果差。水萃取物用明胶去除单宁后 ,基本失去抑制TMV的能力 ,表明单宁在其中起着重要作用。从杠板归与假槟榔种子中提取的总单宁对TMV具有明显的抑制作用 ;病毒粒体样品在分别加入这 2种植物总单宁后 ,电镜下表现为聚集结合 ;TMV分别与这 2种植物的单宁混合后 ,通过透析 ,可恢复大部分侵染力 ,表明单宁对病毒并无直接毒害作用 ;TMV外壳蛋白 (CP)与单宁混合后 ,在蛋白质的聚丙烯酰胺凝胶电泳中表现为结合现象 ;单宁对TMV体内抑制复制效果不明显 ;单宁在接种TMV前后施用并没有降低TMV侵染力 ;这些结果表明这 2种植物单宁对TMV抑制作用可能是与TMV CP结合而引起病毒侵染力下降或影响病毒CP对侵染位点的识别。

双抗TMV+CMV辣椒转基因工程植株的再生及抗病毒鉴定

在构建 Ｔ Ｍ Ｖｃｐ 和 Ｃ Ｍ Ｖｃｐ 双价表 达载体和 建立 辣 椒高 效转 化 体系 的基 础 上用 农杆 菌 介导法转化 辣椒栽培 品种农 大４０ 和湘 研一号。 对５２ 个抗 卡那霉 素再生植 株进行点 杂交 鉴定 ，结果 １６株为 Ｔ Ｍ Ｖｃｐ 和 Ｃ Ｍ Ｖｃｐ 阳 性，而 Ｐ Ｃ Ｒ 检测发 现 其中 有 ２ 株 为假 阳性 株。 进一 步 温室 攻毒 试 验 表明有７ 个 阳性转基 因植株 对 Ｔ Ｍ Ｖ 和 Ｃ Ｍ Ｖ 同时表 现为免疫 。

烟草品种对TMV抗性差异的比较研究

对不同遗传类型的 7个烟草品种设计水杨酸 (SA)预处理与对照 ,而后进行TMV接种和挑战接种 ,调查这些品种的响应程度。发现对TMV侵染的响应可分为花叶和枯斑反应 2种类型。在两个对TMV侵染具有系统获得抗病性 (SAR)特性的烟草品种中 ,品种HZNH在病斑数量、形态及大小等方面与前人已沿用多年的品种Xanthi nc存在明显差异 。

壳寡糖对烟草TMV病毒的诱导抗性研究

以壳寡糖诱导烟草枯斑寄主后,调查了病斑的抑制率,同时研究了壳寡糖单独处理和以病毒粒子侵染诱导的病程相关蛋白的差异。结果表明,壳寡糖处理对TMV侵染有保护作用,施用壳寡糖后7d,以浓度为50μg/mL和75μg/mL对枯斑的抑制效果为好,壳寡糖在活体外对TMV粒子有钝化作用。单独施用壳寡糖可以诱导烟草产生6条耐碱性的PR,其中1条区别于TMV侵染诱导的PR。

壳寡糖诱导转反义mapk基因烟草的TMV抗性和PAL活性研究

壳寡糖具有诱导植物对病原物防御反应的作用,而PAL活性的升高通常被认为是发生抗性反应的标志之一.本文以mapk基因受到反义抑制的转基因枯斑三生烟草为试材,比较了壳寡糖诱导后转基因型和野生型烟草的PAL活性变化及对TMV抗性的变化.由实验结果初步推测,在壳寡糖诱导的植物抗性信号通路中,mapk可能为PAL的一个重要的上游基因,同时mapk在烟草抗TMV信号转导中亦为一个重要组分.

接种TMV的烟草高温胁迫后防御酶活性的变化

采用温度转换和人工接种试验研究了接种TMV的烟草经高温胁迫后防御酶活性的变化。结果表明:烟草接种TMV后经过高温处理(48℃,24h),防御酶中的超氧化物歧化酶(SOD)活性变化较小;过氧化氢酶(CAT)活性在处理后2d内没有明显变化,2d时高于对照;过氧化物酶(POD)、苯丙氨酸解氨酶(PAL)活性均高于对照;多酚氧化酶(PPO)活性在大部分阶段高于对照。因此,CAT、POD、PPO、PAL活性的变化可能与高温诱发烟草对TMV的抗性有关。

TMV或宁南霉素处理对烟草叶片及类囊体膜蛋白组成的影响

对烟草花叶病毒(TMV)侵染、宁南霉素钝化处理的烟草叶片进行了叶片全蛋白多肽组分、类囊体膜蛋白组成的分析.结果表明,TMV侵染或钝化实验的烟草叶片中均出现TMV衣壳蛋白;但是与对照相比,TMV侵染叶片中Rubisco大亚基减少、小亚基增加,类囊体膜蛋白中PsaA、PsaB和Mr=33×103蛋白含量减少.表明TMV侵染要同时影响叶片细胞核基因组和叶绿体基因组的基因表达,从而影响光合作用碳代谢和类囊体膜光系统Ⅰ和Ⅱ.宁南霉素对TMV病毒短时间内具有钝化作用,而较长时间的作用效果不同,10 min钝化样品的蛋白组分保持较为完整,而30 min钝化样品的多肽缺失较为严重.

TMV侵染番茄引起的细胞结构变化及细胞程序化死亡

为研究植物系统反应过程中出现的细胞程序化死亡 (PCD)现象 ,用烟草花叶病毒 (TMV)接种番茄叶片 ,光镜和电镜观察到茎尖顶端细胞出现PCD特征 :线粒体嵴数目减少直至双层膜破毁、前质体基粒扭曲变形、细胞核畸形、核染色质浓缩并边缘化、细胞质和液泡中出现大量环状片层及酚类物质、多泡体出现、细胞壁膨胀扭曲、叶肉细胞的叶绿体基粒和基质片层结构破坏。试验表明 :TMV侵染番茄引起的系统反应过程中有PCD发生 ;

椴叶鼠尾草抗烟草花叶病毒活性成分研究

为寻找新型植物病毒抑制剂,以烟草花叶病毒(TMV)为供试病毒,研究发现入侵植物椴叶鼠尾草提取物具有抗TMV活性。通过半叶枯斑法不同施药方式筛选发现,在质量浓度为1 mg/mL时,石油醚萃取物的保护作用和钝化作用最强,抑制率为40.95%和52.85%;乙酸乙酯萃取物的治疗作用最强,抑制率为52.85%,与阳性对照药剂宁南霉素无显著差异。石油醚萃取物各馏分中,Fr7的保护作用和治疗作用最好,抑制率为40.51%和45.52%,Fr6的钝化作用最好,抑制率为74.63%。乙酸乙酯萃取物各馏分中,Fr1′的保护作用最强,抑制率为61.77%,Fr3′的治疗作用最强,抑制率为55.02%,Fr4′的钝化作用最强,抑制率为60.22%。运用现代色谱波谱技术分离鉴定了5个化合物分别为tilifodiolide、eupatoric acid、熊果酸、齐墩果酸和2-甲基-5,7-二羟基色原酮。

不同烟草品种感染TMV病程过程中CAT、PAL活力变化研究

对两个具有 SAR特性和一个感病烟草资源进行接种 TMV和 SA处理 ,在不同时间测定 CAT、PAL活力值 ,分析不同类型烟草资源病程过程中上述两个酶活力值的动态变化。结果表明 :具有 SAR特性的抗性品种资源对 TMV和 SA表现出较高的敏感性 ,PAL活力值在处理后明显地高于感病资源 ,CAT活力值在处理后低于感病资源 ;其中 CAT活力值的变化早于 PAL酶活力值的变化。两个具有 SAR特性的烟草资源在总体趋势上相一致 ,但存在一定的差异性。

水杨酸对感染TMV烟草叶片PAL活性的影响

用水杨酸(SA)和普通烟草花叶病毒(TMV)诱导且接种抗病烟草品种CV85和感病烟草品种G80,研究其对烟草叶片苯丙氨酸解氨酶(PAL)活性的影响。结果表明,抗、感病烟草品种对照接种处理的PAL活性均较对照增加;抗病烟草品种CV85诱导和诱导接种处理的PAL活性也较对照增加,且较对照接种增加得更为明显,8d时可达活性高峰;而感病烟草品种G80诱导接种后,其PAL活性先增加后降低,而对照接种后PAL活性升高,17d时达到活性高峰;诱导接种并没有增加感病烟草品种的PAL活性,而增加了抗病烟草品种的PAL活性。可见,外源应用SA控制烟草花叶病毒病在抗病品种上表现更好。

烟草与TMV不同互作体系中部分生理指标的测定

测定了烟草与 TMV强毒株系的亲和性互作以及与 TMV弱毒株系的非亲和性互作体系中部分生理指标 ,结果表明 :( 1 )两种互作体系的 SOD活性均明显升高 ,后者活性变化高于前者 ;在互作的早期 ,接种叶 SOD活性明显高于非接种的上、下部邻位叶 ,然而非亲和性互作的后期 ,上部叶 SOD活性上升更快 ,活性值反而超过接种叶。 ( 2 )两种互作体系 CAT活性均升高 ,在非亲和性互作的早期 ,CAT活性显著高于亲和性互作 ,但在互作的 3d后 ,前者活性反而低于后者 ;两种互作体系中的接种叶 CAT活性在互作的前 3d均高于上、下部叶 ,然而在亲和性互作的后期 ,上部叶 CAT活性反而明显高于接种叶和下部叶。 ( 3)两种互作体系中的 POD活性均升高 ,非亲和性互作 POD活性变化亦大于亲和性互作 ;互作早期的接种叶 POD活性高于上、下部叶 ,然而非亲和性互作的上部叶 POD活性很快就反超接种叶。( 4)亲和性互作的后期 ,随着病害症状的显现 ,3种酶活性均再次升高 。

烟草抗TMV育种研究进展

增强TMV抗性是烟草抗病育种的重要目标。简要介绍了烟草TMV的发病症状及防治方法,综述了烟草抗TMV的主要抗源、烟草抗TMV育种进展及生物技术在抗TMV育种中的应用,并就今后如何有效开展烟草抗TMV育种提出了建议。

3个烤烟品系对TMV抗性的遗传规律分析

为更好地利用抗TMV烤烟种质资源,提高烤烟抗TMV育种效率,对烤烟品系CV87、FC8、抗88的TMV抗性遗传规律及抗性来源进行了研究。利用抗病烤烟品系CV87、FC8、抗88分别与感病品种云烟87、中烟100配置杂交组合,构建F1、F2群体,并利用TMV-C菌株进行抗性鉴定;同时,设计N基因引物对参试烤烟品种(系)的基因组DNA进行PCR扩增。经抗性鉴定,CV87、FC8、抗88及F1群体对TMV免疫,云烟87、中烟100感TMV,卡方(χ2)检验证明F2群体抗感分离比为3∶1,符合显性单基因遗传;PCR结果表明,抗病品系CV87、FC8、抗88基因组内存在N基因序列,感病品种云烟87、中烟100基因组内未发现。本研究表明,CV87、FC8、抗88烤烟品系的TMV抗性来源于N基因。