重要人感染RNA病毒复制机制和靶向聚合酶药物开发研究进展

近年来,拉沙热、埃博拉、新冠和尼帕等多种病毒性传染病在世界范围内频繁暴发,给人类健康和社会经济发展带来了巨大威胁。广谱抗病毒药物是主动应对新发突发病毒性传染病的重要手段之一,而其研发的关键是发现病毒特有的保守药物靶点。病毒聚合酶负责病毒基因组的复制和转录过程,蛋白序列相对保守,是理想的药物靶点。本文以重要人感染RNA病毒聚合酶的工作机制和靶向病毒聚合酶的药物开发展开综述,为未来新发突发传染性疾病防控提供新思路和新策略。

基于微流控芯片的核酸样本前处理方法实验研究

构建一种快速免提取核酸释放剂并开发与之匹配的微流控芯片,用于RNA类核酸样本检测的前处理。将表面活性剂Surfactin、蔗糖、Triton X-100、Chelex-100、BSA和无酶无菌水配制成核酸释放剂,并在此基础上设计配套的微流控芯片;采用新型冠状病毒假病毒标准品结合下游RT-RPA检测和RT-PCR检测对几种成分的配比及反应条件进行优化,并评价核酸释放剂的灵敏度、稳定性及其在微流控芯片上的效果。本研究所述的核酸释放剂仅需约10 min即可完成核酸样本的释放,处理后的样本RT-RPA检测限可达1000 copies/mL,RT-PCR检测限可达200 copies/mL;室温放置22天后释放效果未见明显降低;本研究设计的微流控芯片仅需一台简单的离心设备即可运行,主要结构包括样本腔、混匀通道和孵育腔3个部分,配合核酸释放剂使用仍可保持较高的检测灵敏度,处理后的样本RT-PCR检测限为200 copies/mL。本研究所述核酸释放剂稳定性较高,且具有较高的检测灵敏度,与微流控芯片组合使用可实现快速、简便、低成本的核酸检测样本前处理。

干扰素对扩张型心肌病自身免疫和病毒感染的影响

目的 观察干扰素治疗对扩张型心肌病 (DCM )自身免疫和病毒感染的影响。方法 研究对象选择从1 997年 1 0月 - 2 0 0 0年 4月间在我院住院和门诊病人 52例 ,随机分为干扰素治疗组和常规治疗组。病人入选后查血清病毒中和抗体 (VNA)、肠道病毒RNA(EVsRNA)、抗 β受体抗体 (ABRA)、抗M受体抗体 (AMRA)。两组病人在治疗 1、3和 6个月后随访上述指标的阳性率。干扰素治疗组除常规药物治疗外 ,加用干扰素 α(inter feron α) 30 0万单位隔天肌注 ,共 3～ 6月。用State 4 .0统计软件完成卡方检验。结果 在治疗 6个月后干扰素组的ABRA、AMRA和EVsRNA下降明显 ,与常规治疗组比较AMRA和EVsRNA差异有显著性 (P <0 .0 5) ,两组病人VNA在治疗前后差异不明显。结论 免疫调节剂干扰素可以改善DCM的自身免疫损害机制 ,可以降低DCM患者体内病毒复制 。

逆转录聚合酶链反应检测HCV RNA血标本保存条件分析

目的 确定用于丙型肝炎病毒 (HCV)RNA逆转录聚合酶链反应测定的血清 (浆 )标本的最佳收集和保存条件。方法 按设定的不同条件处理 ,用逆转录聚合酶链反应测定HCVRNA。结果 用高压消毒的离心管与未用高压消毒的离心管收集、保存HCVRNA血清 ,其阳性检出率有差异 (P <0 0 5 )。血凝固后 4h内离心分离血清对HCVRNA阳性检出率不造成明显改变 (阳性率为 85 % ) ;12h后检测则变化明显 (阳性率降至 75 % )。采用枸橼酸钠和EDTA K2抗凝剂的血浆管HCVRNA检出率分别为 90 %和 95 % ,显著高于血清管 (为 6 5 % )。反复冻融影响标本阳性检出率 ,标本在 - 2 0℃保存 3个月或半年几乎不影响检测结果。结论 收集和保存HCVRNA检测标本应尽量用EDTA抗凝管 ,在 4h内分离血浆 ;若用血清标本 ,最好在 4h之内分离血清 ,标本长期保存应分装且存放在 - 70℃。

病毒感染与氧化应激的关系

病毒感染和氧化损伤密切相关。病毒感染可引起机体广泛的氧化应激反应,并进一步加重疾病。本文针对RNA、DNA及逆转录病毒,尤其侧重于流感病毒、乙肝病毒和人免疫缺陷病毒,从病毒感染诱导产生活性氧自由基(reactive oxygen species,ROS)的能力、病毒与ROS的相互影响、病毒在机体氧化/抗氧化平衡中发挥的作用、抗氧化剂在病毒感染中的治疗作用等方面对病毒感染和氧化应激的关系作一综述。

福州市入境发热人群部分病毒性传染病病原谱初步研究

目的了解福州市入境发热人群病毒性传染病流行概况及病原谱构成。方法收集2009年5月-2011年5月福州市各主要口岸入境发热人群(体温≥37.5℃)的个案信息,同时采集咽拭子和/或血清标本,采用PCR和RT-PCR方法进行检测分析。结果共截获发热病人192例,采集229份标本,进行主要常见呼吸道病毒和虫媒病毒检测,共检出阳性病例39例,阳性率为20.31%(39/192);检出的病毒包括流感、副流感、呼吸道合胞、登革、偏肺和腺病毒等。结论入境人群存在携带病毒入境的可能,应加强口岸卫生检疫。

人类及动物RNA病毒的反向遗传系统

反向遗传系统可以对RNA病毒直接进行遗传操作 ,为RNA病毒的分子生物学研究提供了一种强大的工具。在过去 2 0年 ,特别是自 90年代中期第一例负链RNA病毒感染性克隆构建成功以来 ,动物RNA病毒的分子生物学研究取得了长足的进展 ,这很大程度上归功于各种动物RNA病毒反向遗传系统的建立。这里系统总结了人类及动物非反转录RNA病毒中各类代表性成员在建立反向遗传系统时的方案设计、遇到的困难及研究者如何克服这些困难。分类讨论到的代表性病毒种属有脊髓灰质炎病毒、冠状病毒 (包括SARS病毒 )、黄病毒、野田村病毒、流感病毒、传染性法氏囊病病毒以及呼肠孤病毒等。

反向遗传学技术及在RNA病毒研究中的应用

RNA病毒的反向遗传学技术是指由病毒的cDNA克隆获取RNA病毒的一项技术,该技术通过人为加入DNA基因片段,实现了在DNA水平上对RNA病毒基因组的人工操作。反向遗传系统可以对RNA病毒直接进行遗传操作,为RNA病毒的分子生物学研究提供了一种强大的工具。自20世纪70年代后期第一例RNA病毒感染性克隆构建成功以来,RNA病毒的分子生物学研究取得了长足的进展,这在很大程度上归功于各种RNA病毒反向遗传系统的建立。文章介绍了反向遗传学技术的基本特点、技术方法及其在正、负链RNA病毒的基因功能、致病机制及新型病毒载体等方面的研究及应用情况。

EB病毒潜伏膜蛋白1对鼻咽癌细胞体外转移能力影响

目的探讨EB病毒（epstein-barr virus,EBV）潜伏膜蛋白1（Iatent membrane protein1，LMP-1）对鼻咽癌（nasopharyngeal carcinoma，NPC）细胞体外转移能力的影响。方法设计针对EBV-LMP-1的特异性发夹状RNA（small hairpin RNA，shRNA）干扰序列，构建2种重组腺相关病毒（recombinant adeno—associated virus，rAAV）载体：rAAV-增强型绿色荧光蛋白（enhance green fluorescent protein，EGFP）和rAAV-shRNA—LMP-1，以不同滴度rAAV-EGFP转染鼻咽癌C666—1细胞确定最佳转染效率（multiplicity of infection，MOI），rAAV-shRNA-LMP-1按MOI转染C666-1，RT-PCR鉴定抑制效率，划痕试验和基底膜穿透试验检验细胞转移能力的变化。结果以rAAV-EGFP5×10^4v．g（virus genome，病毒基因组数），细胞转染C666—1细胞，转染效率大于95％，RT-PCR鉴定rAAV-shRNA—LMP-1以5×10^4v．g／细胞转染C666-1后目的基因抑制效率大于90％，划痕试验显示在相同的时间内，越过划痕边缘移动到空白处的细胞数明显减少（P〈0．01），基底膜穿透试验提示细胞穿透能力显著下降（P〈0．001）。结论通过rAAV介导RNA干扰能有效抑制LMP-1基因表达，并显著抑制了肿瘤细胞的运动及穿透转移能力。

聚乙二醇与二甲基亚砜促进HCV体外感染树鼩肝细胞的作用

目的观察聚乙二醇(PEG)与二甲基亚砜(DMSO)在HCV体外感染树鼩肝细胞中的作用。方法我们采用两步灌流法分离树鼩肝细胞,并用L15培养基予以培养,培养3d接种HCV-RNA阳性血清,在接种感染血清前90min 加40g·L^1PEG与15g·L^1,然后再接种HCV-RNA阳性血清温育6h～8h,并收集不同时相的细胞和上清以逆转录-聚合酶链反应(PT-PCR)法检测其中HCV正负链RNA。结果未加PEG与DMSO时,细胞内正负链RNA首次检出是感染后d5,至d10仍可间断检出,培养上清正链首次检出是感染后d3,d10亦呈阳性;加PEG与DMSO时,细胞内负链首次检出是感染后d3,至d17仍可间断检出,细胞内正链首次检出是感染后d3,至d15仍可间断检出,培养上清正链RNA首次检出感染后d3,至d15亦呈阳性。结论加PEG与DMSO细胞内正负链RNA首次检出时间较早,检出率较高,持续时间较长。

应用荧光定量PCR检测血清中HCV RNA

目的 :探讨荧光定量PCR(FQ PCR)法检测血清中丙型肝炎病毒 (HCV)含量的敏感性、特异性。方法 :采用FQ PCR和逆转录巢式PCR同步检测 76份HCV抗体阳性血清标本 ,并对两种方法的检测结果进行对照比较。结果 :FQ PCR定量HCVRNA拷贝数在 10 2 ～10 6拷贝·μl-1,其中低于 10 3 拷贝·μl-1占 2 0 .93 % ,10 3 ～ 10 5拷贝·μl-1占 60 .47% ,高于 10 5拷贝·μl-1占 18.60 %。 76份HCV抗体阳性血清中 ,巢式PCR检测阳性为 45份 ,FQ PCR检测阳性为 43份 ,二者相对符合率为 97.3 7%。结论 :FQ PCR检测HCVRNA与常规定性巢式PCR特异性、敏感性基本一致。

RNA病毒“拯救”技术

介绍了RNA病毒拯救技术体系建立的简要过程、拯救成功与否的主要影响因素以及优化拯救体系的主要研究进展。着重介绍了该技术在分子病毒学研究和疾病防制中的重要应用及发展前景。

昆虫质多角体病毒研究的若干新进展

质多角体病毒隶属呼肠孤病毒科质多角体病毒属 ,病毒粒子为二十面体球形颗粒 ,具有 3～ 5种结构蛋白 ,基因组由10或 11个节段双链RNA构成。按病毒基因组RNA片段在聚丙烯酰胺或琼脂糖凝胶中电泳图谱的差异 ,将质多角体病毒分为 15个电泳型。随着RNA病毒序列测定策略的逐步成熟与完善 ,质多角体病毒的序列测定方面取得一定的进展 ,家蚕质多角体病毒 1的两个毒株 (H株和I株 ) ,舞毒蛾质多角体病毒 1和 14 ,及粉纹夜蛾质多角体病毒 15的基因组全序列得到了测定 ,但质多角体病毒的进化与起源的研究因缺乏足够的遗传信息仍受到限制。

含4种食源性病毒检测靶标多联装甲RNA的制备、纯化与定值

基于Qβ噬菌体装甲RNA制备平台构建同时含有诺如病毒(norovirus,NoV)、甲肝病毒(hepatitis Avirus,HAV)、轮状病毒(rotavirus,RV)、星状病毒(astrovirus,AstV)检测靶标RNA的多联装甲RNA(multiplexarmoredRNA,AR-MulV),并进行纯化与初步定值。结果表明,重组质粒在大肠杆菌中成功表达,表达产物大小约为14.1 kDa;制备的AR-MulV经纯化后无杂蛋白与残留重组质粒,电镜下可见大量结构形态完整的病毒样颗粒,大小约为25 nm。初步定值结果显示,AR-MulV中GⅠ型NoV、GⅡ型NoV、HAV、RV和AstV检测靶标RNA的含量分别为(1.24±0.2)×10~7、(2.54±0.6)×10~7、(2.24±0.3)×10~7、(2.96±0.5)×10~7 copies/μL和(3.19±0.4)×10~7 copies/μL。本研究基于Qβ噬菌体装甲RNA制备平台成功制备同时包含4种食源性病毒标准方法检测靶标的多联装甲RNA,为食源性病毒的分子检测以及多重实时荧光定量逆转录-聚合酶链式反应阳性质控样品的研发提供新思路。

负链RNA病毒的反向遗传技术

反向遗传技术是一种新的分子生物学技术,它在深入研究负链RNA病毒基因组结构和功能,探寻其基因组复制、转录和研发新型基因工程疫苗上发挥着重要的作用。文章介绍了分节与不分节负链RNA病毒的复制机理和特征,论述了反向遗传学在研究这些病毒上的策略、最新研究进展及其主要影响拯救效率的因素,进一步涉及了负链RNA病毒载体及其重组病毒的研究动态。因此,通过反向遗传学,人们将更加了解负链RNA病毒,为科学利用和有效控制该病毒奠定基础。

庚型肝炎病毒RNA NS3区基因分型

目的：探讨HGVNS3区基因变异与基因型的关系。方法：对32株NS3区序列进行酶切位点分析，比较中国株与GBV－C株和已发表的HGVNS3区酶切位点，选择特异性内切酶切点。结果：32株NS3序列酶切位点分析表明存在5种基因型。1组：在4338位无HhaI切点，而在4360位有HhaI切点；2组：4338位及4360位均无HhaI切点；3组：仅在4338位有HhaI切点；4组：4338位及4351位有HhaI及Tsp509I切点；5组：4351位有Tsp509I切点。其核苷酸变异率分别为0．85％、19．0％、20．5％、18．2％、19．6％等。结论：中国株与西非、东非、加拿大、美国及日本株不是同一基因型。

正链RNA病毒基因组的复制

许多正链RNA病毒是严重危害人类健康的病原体,是造成经济植物动物死亡的致病因子.正链RNA病毒的基因组为正链RNA,其复制酶是依赖RNA的RNA聚合酶,非编码区是病毒基因组复制的主要调控位点,3’非编码区是复制酶的第一结合位点,正链RNA病毒基因组大多可能按copy-back模型进行复制.瘟病毒基因组的复制过程出现正链复制本的数量大于负链复制本的数量,这可能是以RF中间体的负链RNA为模板、正链RNA被置换的形式进行复制的结果.本文概述了HCV细胞培养系统的研究进展.

动物RNA病毒反向遗传学操作技术及应用进展

本文简述了反向遗传操作技术的基本原理以及近年来动物RNA病毒基因复制与表达调控机理、病毒与宿主间的相互作用,以及构建新型病毒载体和研发新型疫苗等方面的研究进展。

植物抗病毒分子机制的研究进展

植物在进化过程中为微生物提供了丰富的物质环境,微生物的生存依赖于植物的生物合成和产生能量的能力。有近450种植物致病病毒,可导致一系列的疾病。但植物不是被动地面对病毒的攻击,而是进化了精细而有效的防御机制来抵抗、限制或损害病毒的感染。植物抗病基因(R-gene)可以抵抗包括病毒在内的多种病原体。由特定病毒而引发的防御反应是先天固有的,而且研究人员已经鉴定了与这种防御反应相关的细胞学和生理学特性。作为抵抗外来核酸(包括病毒)的重要细胞防御途径,RNA沉默近来获得了显著性的研究进展。在植物中这些途径的协同作用有效地防御了病毒的感染。

单股正链RNA病毒基因组非编码区结构与功能研究进展

单股正链RNA病毒基因组末端的非编码区(non-coding region,NCR)不仅参与RNA-RNA间相互作用,还可以通过与反式作用因子(trans-acting factor)结合,发挥对病毒基因组的复制、转录和组装等过程的调控作用。本文对近年来一些关于单股正链RNA病毒基因组非编码区的结构与功能研究进展情况进行综述。