大肠杆菌O157:H7VT2毒素基因的克隆及测序

目的 克隆出血性大肠杆菌O15 7:H7的VT2毒素基因。方法 利用PCR技术从出血性大肠杆菌O15 7:H7染色体基因组中扩增出VT2毒素基因 ,并连接至pGEM -T载体上 ,构建重组质粒pGVT2并进行序列测定。结果与结论 酶切分析表明重组质粒含有VT2毒素基因 ,核苷酸序列分析表明 ,其序列与GenBank上O15

大肠杆菌O157:H7中编码vt2基因的噬菌体的分离与鉴定

根据GenBank中VT1、VT2毒素的基因序列设计合成2对引物,以大肠杆菌O157:H7菌株DNA为模板,扩 增vt1、vt2。诱导只扩增出vt2的菌株释放噬菌体,利用多种指示菌经双层琼脂平板法来分离纯化VT2噬菌体,观 察噬菌斑的特征,提纯病毒粒子进行电镜观察,并对噬菌体中vt2基因检测、克隆和序列分析。结果显示VT2噬菌 体感染MC1061在双层琼脂平板上形成的噬菌斑小而混浊,多呈磨玻璃样;而首次感染大肠杆菌CC118(λpir),此 后用MC1061分离的噬菌体,再以MC1061为指示菌,在双层琼脂平板上形成小而清晰透明的噬菌斑。电镜下噬 菌体头部呈六边形外廓,尾部细长无尾鞘结构。以噬菌体DNA为模板进行PCR扩增,检测到vt2特异性DNA 带,克隆的vt2基因序列与GenBank中编码VT2毒素的核苷酸序列(X07865,NC_002655,BA000007,AF291819) 的同源性分别达到99％,确定编码VT2毒素的基因位于噬菌体上,并获得VT2噬菌体(?)HY。

大肠杆菌VT2噬菌体的分离与溶源转染

本试验利用指示菌MC1061,经双层琼脂法纯化和PCR扩增vt2基因,分别从大肠杆菌O157菌株、牛粪、鸡粪和污水中分离获得5株含vt2基因的噬菌体。这些噬菌斑透明,直径为0.5-2mm,对指示菌的感染效价均在109PFU/mL以上,抵抗氯仿和56℃30min的作用。将噬菌体分离株SHφW1感染MC1061后,经PCR鉴定获得一株溶源菌株(MC1061/SHφW1)。溶源株的LB培养滤液对Vero细胞产生了显著的病变效应,而MC1061在同等条件下培养的滤液无细胞病变,表明VT2噬菌体通过溶源将vt2毒力基因水平转移,证实了VT2噬菌体的转染与细菌毒力相关。

大肠杆菌O157噬菌体中vt2基因A、B亚单位的克隆与序列分析

根据GenBank中毒素基因vt1、vt2序列设计合成4对引物，以大肠杆菌O157菌株DNA为模板，扩增vt1、vt2，从只含有vt2的菌株中诱导释放噬菌体，以噬菌体DNA为模板进行PCR扩增，获得vt2、vt2-A、vt2-B3条特异性DNA带；将vt2-A、vt2-B扩增产物纯化后，分别插入pMD18-T载体，测序结果与相应序列比较，vt2-A和vt2-B亚单位的基因序列与GenBank中编码VT2毒素的A、B亚单位的核苷酸序列(X07865，NC_002655，：BA000007，AF291819)的同源性分别为98％～99％、96％～100％，确定vt2位于噬菌体，并为进一步研究大肠杆菌O157中VT噬菌体的毒力转导、VT2毒素的表达和应用奠定基础。

大肠杆菌vpr基因突变株的构建及其特性鉴定

将重组自杀性质粒 p YYvpr转化到含全 vpr基因的 E.coli MC10 6 1感受态细胞中 ,利用卡那霉素抗性筛选到 6个菌落 ,经 PCR和 Southern blot进一步验证 ,得到一个可靠的 vpr同源基因突变株 ,即 MC10 6 1△ vpr。该突变株与亲本 MC10 6 1具有相似的生长特征。噬菌体裂解试验表明 ,突变株对 VT2噬菌体 C43b不敏感 ,而 MC10 6 1敏感 ,可见大量的蚀菌斑。噬菌体溶原试验表明 ,MC10 6 1和突变株 MC10 6 1△vpr对噬菌体的敏感性无差别。所有这些表明 ,vpr基因与 VT2噬菌体的裂解性有关 ,可能是编码 VT2噬菌体受体蛋白的基因。