vvIBDV诱导幼鸡免疫细胞凋亡的研究

为研究超强毒传染性法氏囊病病毒 (vvIBDV)感染的致病机理 ,在 3— 6周龄SPF幼鸡法氏囊、脾脏、胸腺细胞培养体系中加入vvIBDV ,以流式细胞术 (FcM)、DNA琼脂糖凝胶电泳技术检测vvIBDV诱导的细胞凋亡 ,结果表明 ,在本实验的体外培养体系中 ,vvIBDV可直接和迅速引起幼鸡法氏囊细胞凋亡 。

中等毒力IBD疫苗对SPF鸡人工感vvIBDV的免疫保护作用的研究

本试验选用在山东省普遍使用的两种中等毒力IBD疫苗,分别在12和19日龄两次免疫SPF鸡,二免后13天人工接种vvIBDV,连续观察14天。结果表明,这两种疫苗均能有效地保护vvIBDV对SPF鸡的感染,而且也进一步证明,这两种疫苗免疫SPF鸡后,均能对SPF鸡法氏囊、胸腺、脾脏等免疫器官产生不同程度的病理性损伤并且这种损伤是可逆性的。

泰山松花粉多糖对鸡感染vvIBDV诱导的免疫抑制的免疫调理作用

鸡传染性法氏囊超强毒株（vvIBDV）可引起鸡群高死亡率及严重的免疫抑制，给养禽业带来巨大的经济损失。为了探究泰山松花粉多糖（TPPPS）对鸡传染性法氏囊病（IBD）的免疫调理作用，本研究以IBDVGX8／99超强毒株经鼻腔感染19日龄SPF鸡，并分别于感染前、后连续14d口服饲喂TPPPS，同时设置IBD疫苗对照组，病毒对照组和健康对照组，分别对各组试验鸡体质量及法氏囊指数、法氏囊带毒量及抗体变化，以及其他相关免疫学指标进行检测比较。结果显示，连续14d口服TPPPS后，试验鸡体质量及法氏囊抑制程度得到明显改善，法氏囊带毒量减少，法氏囊损伤程度降低，IBD抗体分泌提前、分泌量增加，IL-2、IL-4细胞因子分泌水平提高，T淋巴细胞转化率、CD4＋和CD8＋T细胞数增加，ND抗体水平提高，其中TPPPS预防组的各项检测指标均高于TPPPS治疗组和IBD疫苗组。结果表明，TPPPS对vvlBDV诱导的鸡群免疫抑制具有一定的免疫调理作用，且以在病毒接种前口服TPPPS发挥的免疫调理作用最显著，TPPPS可以作为免疫增强剂用于防控vvIBDV的早期感染，降低其免疫抑制程度，减少经济损失。

传染性法氏囊病超强毒Gx株的致弱研究

本研究成功将鸡传染性法氏囊病超强毒vvIBDVGx株通过SPF鸡胚的快速培育及鸡胚成纤维细胞传代致弱 ,揭示了vvIBDV从超强毒力向弱毒力转化过程中 ,其主要结构蛋白VP2基因核苷酸及推导的氨基酸序列的变化规律。对不同代次细胞毒进行了序列分析 ,发现细胞毒在第 7代以前 ,VP2基因序列没有改变 ,与欧洲标准超强毒氨基酸同源性达 10 0 % ;细胞毒第 8代 ,有个别核苷酸发生了改变 ,但没有影响氨基酸序列 ;细胞毒第 9代是变化复杂的过渡代 ;10代毒VP2基因与欧洲标准弱毒Cu_1氨基酸序列同源性达 97% ;以后的细胞适应毒至 2 0代 ,其VP2基因序列不再改变。致病性实验表明原代毒对 4周龄SPF鸡致死率为 6 4 % ,细胞毒第 5代的致死率为 6 0 % ,而 2 0代毒对鸡无致病性 ,在鸡体内连续传代

传染性法氏囊病病毒超强毒HZ株和XN株VP2基因的克隆和序列比较

根据已发表的 5 2 / 70株 IBDV基因组序列 ,设计并合成了一对特异扩增IBDV VP2基因的引物。以陕西地区分离的IBDV野毒 XN株、HZ株为材料 ,以其基因组为模板利用 RT- PCR技术扩增出了 1 .5kb 的 c DNA 产物 ,将 VP2基因克隆于PUC1 1 9质粒上 ,得到重组 PUC1 1 9质粒。并对 VP2基因全序列测定、分析和聚类表明 ,XN株和 HZ株与欧洲超强毒株非常相似 ,而与经典强毒株、弱毒株和变异株相差较大。

4株IBDV分离株VP2基因的序列分析及原核表达

RT-PCR扩增获得4株鸡传染性法氏囊病毒(IBDV)分离株(GT、HN、ZB、BZ)VP2基因并测序,序列分析结果表明:各基因全长均为1356bp,编码452个氨基酸残基;核苷酸、氨基酸序列同源性分别在93.2%～99.9%与93.6%～100%之间;除HN株与经典毒株Cu-1核苷酸同源性为95.5%外,其余3株均为95.6%;GT、HN、ZB及BZ株与VariantE株核苷酸同源性均为95.9%;该4株病毒与北欧、非洲、西亚、东南亚、东亚等地区于1998～2008年报道的超强毒株的核苷酸与氨基酸序列同源性均非常高。根据VP2蛋白氨基酸序列特征,HN、ZB、BZ株病毒皆为超强毒株(vvIBDV),GT株除254位氨基酸残基为变异株特征性的S(丝氨酸)外,其余均与超强毒株特征相符。以GT株VP2基因克隆至原核表达载体pBV220,转化大肠杆菌BL21(DE3),低温培养后42℃热诱导,并对诱导产物进行SDS-PAGE、Western-blot分析。结果显示,目的基因获得表达,并与阳性抗体具有良好的反应原性,为以VP2为基础的基因工程亚单位疫苗的研制奠定基础。

“禽福、亿妙灵”对雏鸡IBD疫苗接种后免疫细胞数量的影响

分别应用免疫组织化学和组织化学方法对使用免疫增强剂“禽福”和“亿妙灵”的1日龄SPF雏鸡接种IBD疫苗后,对其免疫器官胸腺、法氏囊、脾脏的T细胞和IgG、IgM、IgA抗体生成细胞数量的动态变化进行了较全面系统的研究。结果表明,不论是使用“禽福”,还是“亿妙灵”的雏鸡,接种IBD疫苗后,其上述各项被检指标均不同程度地高于IBD疫苗单独接种雏鸡。其中,“禽福”IBD疫苗接种雏鸡又较“亿妙灵”IBD疫苗接种雏鸡明显增加。表明免疫增强剂“禽福、亿妙灵”能明显提高雏鸡对IBD疫苗的免疫应答,增强IBD疫苗接种雏鸡对vvIBDV攻击的免疫保护率。

传染性法氏囊病病毒结构的分子生物学研究进展

传染性法氏囊病是一种严重危害雏鸡的免疫抑制性、高度接触性传染病.传染性法氏囊病病毒为双RNA病毒,有A、B两个片断.A片断编码4种蛋白VP2,VP3,VP4和VP5,B片断编码VP1蛋白.其中的VP2和VP3是主要的宿主保护性抗原,在病毒的结构、变异、毒力和免疫原性方面有着重要的作用.

基于内部核糖体进入位点提高重组NDV表达IBDV VP2基因的研究

为提高重组新城疫病毒(NDV)外源基因表达量,本研究采用内部核糖体进入位点序列(IRES)构建表达鸡传染性法氏囊病病毒超强毒(vvIBDV)H LJ07株V P2双拷贝基因的重组NDV(rClone30-V P2-IRES-V P2),同时构建表达单拷贝V P2基因的重组NDV(rClone30-V P2)作为对照。间接免疫荧光试验表明V P2蛋白在感染两种重组病毒的鸡胚成纤维细胞(DF-1)中得到表达。Real-time PCR检测结果表明rClone30-VP2-IRES-V P2中VP2 mRNA转录水平明显高于rClone30-VP2。生长曲线分析表明,两株重组病毒株与亲本NDV LaSota(Clone30)株在细胞培养中可以同样稳定复制。重组病毒株在鸡胚中多次传代之后仍稳定表达VP2蛋白。本研究通过建立NDV的反向遗传操作系统构建了独立表达IBD V双拷贝V P2基因的重组NDV,并证明双拷贝基因的表达水平优于单拷贝基因,为提高重组NDV外源基因的表达量提供了新的思路。

浅谈不同免疫程序和方法对IBD疫苗免疫效果的影响

鸡传染性法氏囊病（Infectious Bursal Disease，IBD）是由传染性法氏囊病病毒（IBDV）引起的一种高度接触性传染病，主要侵害雏鸡和青年鸡的法氏囊等器宫，破坏法氏囊中的B淋巴细胞，导致免疫抑制，使病鸡更易感染其它疾病。80年代末欧洲、亚洲等国家开始逐渐有超强毒IBDV （vvIBDV）的流行。致使IBD的流行出现发病鸡群的死亡率可达到90％，发病年龄增高的新特点，使IBD成为严重影响养鸡业发展的主要的烈性传染病。

鸡传染性法氏囊病超强毒致弱株的生物学特性研究

将vvIBDV国内分离株-G株经SPF鸡胚和鸡胚成纤维细胞连续传代致弱，得到适应细胞的致弱株。暂命名为IBDVGt。其毒价为2.0×108PFU／ml以上，具有较好的抗原性，对鸡无致病性。返祖试验及病理组织学试验证明，致弱株可在鸡体内连续传至4代，未有返强现象。

传染性法氏囊病病毒超强毒GZ株VP2基因的克隆和序列分析

根据已发表的传染性法氏囊病病毒 ( IBDV) 5 2 /70株基因组序列 ,设计并合成了 1对特异扩增 IBDVVP2基因的引物。以 IBDV超强毒 ( vv IBDV) GZ株基因组为模板 ,利用 RT-PCR技术扩增出了 1 .5 kb的c DNA产物 ,将 VP2基因克隆于 p UC1 1 9质粒上 ,得到重组 p UC1 1 9质粒。对 VP2基因全序列进行了测定。序列分析和聚类分析表明 ,GZ株与欧洲超强毒株 UK6 6 1非常相似 ,而与经典强毒株。

传染性法氏囊病病毒超强毒株致弱的分子生物学特征

为了探索传染性法氏囊病病毒 ( IBDV)超强毒株致弱的分子特征变化 ,采用 RT-PCR技术 ,从超强毒 ( vv IBDV)及其不同代次细胞传代致弱毒中扩增到编码 VP2蛋白的 c DNA高变区基因 ,并对其序列测定。将 vv IBDV及其致弱毒株 VP2高变区的氨基酸与其它血清 I型毒株比较 ,发现 vv IBDV与其致弱毒株在VP2高变区的 2 2 2、2 4 2、2 53、2 56、2 71、2 79、2 84、2 94、2 99和 3 0 0位氨基酸发生了改变 ,而这些氨基酸的变化使亲水区和七肽区发生了改变 。

鸡传染性法氏囊病病毒超强毒上海株SH95基因组B片段的克隆与分子系统进化树分析

分离、纯化了鸡传染性法氏囊病病毒超强毒(vvIBDV)上海株(SH95)的病毒核酸dsRNA,应用随机引物将RNA反转录成cDNA,以此为模板一步扩增出全长基因组B片段,将其克隆入pGEM-T载体,并进行序列分析。克隆的B片段全长2827个核苷酸,其编码的氨基酸与超强毒株HK46的同源性达98 18%(863/879)。分子系统进化树分析表明,SH95超强毒株与美国变异株E的亲缘关系最近,但与基于基因组A片段的系统进化分析完全不同,表明该毒株在发生过程中基因重配比基因重组发挥了更重要的作用。通过对14株IBDV编码氨基酸序列的分析、比较,推测B片段上11个独特的氨基酸位点可能与毒力相关。

IBD野毒株的培育

由国内ＩＢＤ高发地区分离到一株ＩＢＤ野毒，使现地鸡群发病率９６％，死亡率６０％以上，为一株超强毒。将该毒株分离，纯化，经鸡胚及鸡胚成纤维细胞传代，得到一株ＩＢＤ超强毒的细胞适应株，毒价高达２．０×１０８ＰＦＵ／ｍｌ以上。回归本动物，经免疫原性试验，致病性试验及返祖试验，证明该毒株免疫原性较好而致病力降低。

IBDV超强毒HZ株VP2基因的克隆和真核表达质粒的构建

利用反转录 -聚合酶链反应 (RT- PCR) ,扩增克隆传染性法氏囊病病毒超强毒 (vv IBDV) HZ株 VP2基因 ,并对 VP2基因进行全序列测定、序列分析和聚类分析 ,同时将VP2基因与真核表达载体 pc DNA3相连接。结果克隆到 VP2基因全序列长 1 356bp,分析表明 HZ株与欧洲超强毒株 UK661高度相似 ,同时将 VP2基因正向插入 pc DNA3的 CMV启动子下游 ,得到了 VP2基因的真核表达质粒。为

传染性法氏囊病病毒上海超强毒株VP2-4-3基因真核表达质粒的构建与表达

应用Long and Accurate—PCR(LA-PCR)技术,扩增克隆了鸡传染性法氏囊病病毒上海超强毒(wIB-DV)的VP2—4—3基因。应用粘性末端连接策略,将VP2-4-3基因克隆人真核表达载体pALTER-MAX。经酶切鉴定,表明VP2-4-3基因为正向插入,位于CMV启动子下游。该真核表达质粒在脂质体的介导下转染Vero细胞,经特异性抗IBDV抗体的免疫荧光检测,发现在细胞内有特异蛋白表达。

复合中草药提取物对IBD中等毒力活疫苗免疫增强作用的研究

选用两种在山东省普遍使用的中等毒力IBD活疫苗,将240只试验用商品鸡分成12组,分别在12日龄和19日龄两次免疫,同时在11日龄时用复合中草药提取物饮水,连用7 d,二免后13 d人工接种vvIBDV,连续观察14 d。结果表明,无论从抗体水平、囊指数、BBIX值、B淋巴细胞EAC花环形成率、T淋巴细胞ANAE阳性率、红细胞(RBC)免疫黏附功能,还是从病理组织学检查、临床保护率、病理保护率等指标来看,都充分表明该复合中草药提取物对中等毒力IBD活疫苗具有显著的免疫增强作用,而且对提高法氏囊等免疫器官的保护作用及疫苗对其损伤后的修复作用也有显著效果。

鸡传染性法氏囊病上海超强毒株NH99的分离与鉴定

通过对上海近郊某鸡场数群 10日龄左右的病鸡的临床症状、病理变化、病毒分离、纯化、动物回归、血清学检测及病毒核酸纯化、VP2基因序列的测定与分析 ,确认上海地区以发病日龄早 ,发病率、死亡率高为特征的鸡传染病为超强毒型鸡传染性法氏囊病 ,病原具有鸡传染性法氏囊病病毒超强毒 (vvIBDV)的分子特征 ,为vvIBDV。

鸡传染性法氏囊病病毒超强毒株HLJ-0504 VP5基因缺失株感染性克隆的构建及鉴定

利用体外定点突变技术,缺失vvIBDV HLJ-0504株VP5基因,通过多重PCR在基因组两端分别引入锤头状核酶序列(HamRz)和丁肝病毒核酶序列(HdvRz)。将带有核酶序列的IBDV基因组插入载体pCAGGs的β肌动蛋白启动子下游,构建了IBDV感染性克隆pCAGGHLJ0504A△ VP5HRT,将该感染性克隆与pCAGGHLJ0504BHRT共转染DF-I细胞。IFA,RT-PCR,电镜观察均显示获得重组病毒,将其命名为rHLJ0504HT△VP5。vvIBDV VP5基因缺失感染性克隆的成功构建为我们利用反向遗传操作技术快速致弱vvIBDV,构建IBD的候选疫苗株奠定了基础。