Western印迹法分析蓖麻毒素在正常小鼠血清和肝组织匀浆中的稳定性

以重组蓖麻毒素A链（rRTA）免疫家兔,制备的抗rRTA兔血清效价高,能达到1∶51200.以兔多抗血清为检测抗体,建立蓖麻毒素的Western印迹检测法,对蓖麻毒素检测灵敏度可达1 ng.含有蓖麻毒素的小鼠血清和肝组织匀浆（蓖麻毒素终浓度为0.67μg/mL）在37℃孵育0~4 h后,应用此法体外观察蓖麻毒素在正常小鼠组织样品中的稳定性,结果显示Western印迹可用于组织中蓖麻毒素的测定,蓖麻毒素可在小鼠血清和肝组织匀浆中稳定存在.

Western印迹检测人肾细胞癌中NF-κB信号通路分子蛋白的表达水平

目的应用Western印迹方法检测人肾细胞癌组织及癌旁组织中NF-κB信号通路蛋白表达,探究NF-κB信号通路与人肾细胞癌之间的可能关系。方法手术获得3对人肾细胞癌组织标本以及相应的癌旁组织标本,利用Western印迹方法检测人肾细胞组织以及相应癌旁组织中NF-κB信号通路蛋白p-IκB、NF-κB P65以及NF-κB P50表达水平。结果与相应癌旁组织比较,人肾细胞癌组织中NF-κB信号通路蛋白IκBa表达水平明显下降,而NF-κB信号通路蛋白NF-κB P65和NF-κB P50表达水平明显升高。结论人肾细胞癌的发生可能与NF-κB信号通路存在一定的相关性。

人血清P21蛋白的Western印迹测定

建立了Ｗｅｓｔｅｒｎ印迹法测定人血清中ｒａｓ癌基因蛋白的方法，检测限值为３ｍｇ／Ｌ血清。丽春红Ｓ染色后裁掉非靶蛋白部分硝酸纤维素膜，可大量节约一抗的用量；微波炉促进免疫结合，加速显色过程；用国产碱性磷酸酶ＡＢＣ试剂，可降低成本；实验结果可用５６０ｎｍ波长的色谱扫描或血清系列稀释法进行定量，并已用于职业肿瘤高危人群的筛检。

乙醇固定对肿瘤细胞的蛋白质提取及Western印迹的影响

为研究乙醇固定后肿瘤细胞的蛋白质提取及 Western印迹的可行性。于低温 (4℃ )或常温条件下裂解经75 %冷乙醇固定的肿瘤细胞 (HL- 6 0细胞和 Molt- 4细胞 ) ,提取细胞蛋白质进行 SDS- PAGE凝胶电泳和 Western印迹。结果显示经预处理后的肿瘤细胞中提取的蛋白质不论是在 SDS- PAGE后的考马斯亮蓝染色 ,还是转膜后的 Western印迹均可得到可分析的蛋白质条带。提示 75 %冷乙醇固定的肿瘤细胞仍适用于 SDS- PAGE和 Western印迹 ,并可结合流式细胞术对肿瘤细胞蛋白质进行细胞周期定性、定量和定时相的同步分析。

Western印迹分析嗜人按蚊中肠膜蛋白免疫原性

采用Western-blot免疫学方法对嗜人按蚊中肠粗蛋白和膜蛋白(即纯化后的粗蛋白)分子量及免疫原性进行分析.结果,经SDS-PAGE电泳,嗜人按蚊中肠粗蛋白显示8条主带,分子量范围在(66 200～15 850Da);而膜蛋白显示4条主带,分子量范围在(66 200～35 480Da).利用中肠粗蛋白免疫小鼠所获得的抗血清,可特异性识别粗蛋白中的3个条带;而特异性识别膜蛋白的仅1条,分子量为38.9 kDa.可见,利用蔗糖不连续梯度离心可获得膜蛋白,该蛋白含有与抗蚊中肠粗蛋白抗体相结合的膜蛋白表面抗原,这对今后制备嗜人按蚊中肠单克隆抗体具有参考价值.

Western印迹技术研究神经管发育和神经管畸形鼠胚Bcl-2蛋白的表达

目的:探讨转染外源性bcl-2基因后,能否通过Bcl-2蛋白表达抑制凋亡,从而减轻和改善鼠胚神经管缺陷的程度。方法:分别取维甲酸致神经管缺陷鼠胚、转染正义bcl-2DNA的神经管缺陷鼠胚、正常鼠胚、转染反义bcl-2DNA的正常鼠胚神经管组织,用Western免疫印迹实验技术检测Bcl-2蛋白和Bax蛋白的表达情况。结果:经转染外源性bcl-2后,神经管缺陷鼠胚的Bcl-2蛋白表达升高,神经管缺陷程度得到改善。结论:维甲酸对内源性bcl-2的抑制包括了mRNA水平和蛋白水平。本实验从蛋白表达水平证实了外源性bcl-2转染成功并有表达。

Western印迹技术在重组人肿瘤坏死因子α衍生物质控中的应用

本文报告用Ｗｅｓｔｅｒｎ印迹技术对，ｒ－ｈＴＮＦαＤ进行定性分析。实验结果表明，该技术具有特异和灵敏的特点，尤其在ｒ－ｈＴＮＦαＤ纯度测定中起十分重要的作用。

用于未纯化蛋白样品核酸适配体筛选的Western印迹-SELEX筛选技术的建立

目的:建立一种基于Western印迹的指数式富集的配体系统进化(SELEX)技术,用于未纯化蛋白样品核酸适配体筛选。方法:将目的蛋白经SDS-PAGE分离后转移到PVDF膜上,用生物素标记的ss DNA与PVDF膜上的蛋白共同孵育,获得能与靶蛋白特异结合的适配体,最后通过生物素-链霉亲和素-辣根过氧化物酶系统、基因克隆测序、MEME在线软件和RNAstructure软件分析适配体的一、二级结构,并对筛选得到的适配体进行鉴定。结果:经过4轮筛选,获得了能特异识别靶蛋白而不识别无关蛋白的适配体,原库Gp45则与上述蛋白均没有结合。结论:建立了Western印迹-SELEX技术,可用于未纯化蛋白样品核酸适配体筛选。

Western印迹中蛋白质定量分析的替代方法

Western印迹广泛采用显像密度计法对特异性蛋白质表达进行定量,但是仍然存在敏感性的问题尚未解决。同时,昂贵的试剂与复杂的设备限制了其应用。建立了一种改良定量检测法,使用碱性磷酸酶标记的第二抗体,以萘酚磷酸盐和快红作反应底物。吸附膜上的终末显色用有机溶剂洗脱,通过测定光吸收值定量。结果显示该法更简便、快速、经济而不失其敏感性。

蛋白质酪氨酸磷酸化-免疫沉淀及Western印迹两种方法的比较

为了深入了解在细胞信息传递中蛋白质酪氨酸磷酸化研究的较佳方法，采用免疫沉淀法及Ｗｅｓｔｅｒｎ印迹法对电离辐射诱导的小鼠胸腺细胞蛋白质磷酸化进行了比较分析。免疫沉淀结果表明，照射后１７５００、２２０００、２８０００、３２０００、４００００、４３０００及５３０００蛋白分子发生酪氨酸磷酸化。Ｗｅｓｔｅｒｎ印迹结果表明，照射后２８０００、３２０００蛋白分子发生酪氨酸磷酸化。提示在蛋白质酪氨酸磷酸化的研究中，免疫沉淀法优于Ｗｅｓｔｅｒｎ印迹法。

非小细胞肺癌组织MAGE-1蛋白的Western印迹分析

目的检测黑素瘤抗原-1(MAGE-1)蛋白在非小细胞肺癌(NSCLC)中的表达,探讨以该蛋白作为疫苗对NSCLC患者进行免疫治疗的可能性。方法采用Western印迹法对3种人肺癌细胞系和56例NSCLC标本及相邻正常肺组织标本MAGE-1蛋白的表达情况进行研究。结果3种人肺癌细胞系均表达MAGE-1蛋白;56例NSCLC标本中,25例表达MAGE-1蛋白,而相邻正常肺组织均不表达。结论MAGE-1蛋白在NSCLC中呈高频率表达,提示该蛋白有望成为对NSCLC患者进行免疫治疗的适宜靶点。

Western印迹方法测定血清中胰岛素样生长因子结合蛋白-3水平

目的 研究正常人及生长激素分泌异常病人血清中胰岛素样生长因子结合蛋白３（ Ｉ Ｇ Ｆ Ｂ Ｐ３） 的水平。方法 本文采用 Ｗｅｓｔｅｒｎ 印迹方法测定２０ 例正常人，３３ 例活动性肢端肥大症病人和３４ 例特发性生长激素缺乏症（ Ｉ Ｇ Ｈ Ｄ） 病人血清 Ｉ Ｇ Ｆ Ｂ Ｐ３ 水平。结果 正常成人血清中存在五种分子量不同的 Ｉ Ｇ Ｆ Ｂ Ｐ， Ｉ Ｇ Ｆ Ｂ Ｐ３ 含量为最高。本文测定了２０ 例正常成人和６７ 例生长激素分泌异常患者血清 Ｉ Ｇ Ｆ Ｂ Ｐ３ 的相对光密度（ Ｒ Ｏ Ｄ） ，正常人血清 Ｉ Ｇ Ｆ Ｂ Ｐ３ 含量为（１ ．１ ±０ ．４） Ｒ Ｏ Ｄ，活动性肢端肥大病人为（２ ．７ ±１ ．２） Ｒ Ｏ Ｄ，明显高于正常成人（ Ｐ＜ ０ ．０１） ， Ｉ Ｇ Ｈ Ｄ 病人为（０ ．４ ±０ ．２） Ｒ Ｏ Ｄ，明显低于正常成人（ Ｐ＜ ０ ．０１） 。血清生长激素与 Ｉ Ｇ Ｆ Ｂ Ｐ３ 、胰岛素样生长因子 Ｉ与 Ｉ Ｇ Ｆ Ｂ Ｐ３ 均呈正相关（ Ｐ＜０ ．０５） 。结论 Ｗｅｓｔｅｒｎ 印迹测定血清 Ｉ Ｇ Ｆ Ｂ Ｐ３ 正常值和病理值提示 Ｉ Ｇ Ｆ Ｂ Ｐ３ 浓度的变化与生长激素功能状态密切相关，并依赖 Ｇ Ｈ。

Western斑点印迹法检测致病性副溶血弧菌

目的:对副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus,VP)的直接耐热溶血毒素(thermostable direct hemolysin,TDH)进行分离纯化,建立Western斑点印迹法技术检测致病性副溶血弧菌的方法。方法:用直接耐热溶血毒素免疫小鼠得到特异性抗血清,利用棋盘方法确定免疫血清最佳工作浓度,并对致病性与非致病性副溶血弧菌分别进行特异性测定。结果:最佳免疫血清最佳工作浓度为1:3200;检测致病性副溶血弧菌为阳性,非致病性副溶血弧菌属呈阴性。结论:Western斑点印迹法技术可以特异性检测致病性副溶血弧菌,灵敏度高、操作简单,可用肉眼判定结果。

快慢转法及不同滤膜和显色检测法在Western blotting中的应用分析

目的探讨快、慢转法及不同滤膜和显色检测法在Western blotting中的应用及各实验环节分析。方法采用MDA-MB-231细胞制备细胞蛋白,应用不同印迹膜[硝酸纤维素膜、聚偏乙烯二氟(PVDF)膜和阳离子尼龙膜]分别采用快转法和慢转法进行增强化学发光法(ECL)和DAB化学显色法检测,并对Western blotting的各实验环节进行了分析。结果(1)在快、慢转法中硝纤膜的蛋白预染marker条带略强于尼龙膜,而尼龙膜又略强于PVDF膜;PVDF膜和尼龙膜的正反面易于混淆,而硝纤膜的正反面不易混淆。(2)在快、慢转法中,PVDF膜的DAB化学显色法图像略强于尼龙膜和硝纤膜,而尼龙膜和硝纤膜无明显差异;与慢转法相比,快转的硝纤膜和尼龙膜中的蛋白条带略呈波浪状。(3)在慢转法中三种膜化学发光法的图像无明显背景,但在快转法中尼龙膜的背景较明显,而硝纤膜和PVDF膜亦无明显背景。结论应根据实验需要选用不同的印迹膜;慢转法通常优于快转法,增强化学发光法优于DAB化学显色法;增强化学发光法特异胜强、灵敏度高,是分析蛋白质表达较为理想的方法。

46例非小细胞肺癌Westernblot与免疫组化神经内分泌表达的检测

目的 :探讨Western印迹法与免疫组化在非小细胞肺癌中神经内分泌 (NE)分化诊断中的价值。方法 :对4 6例非小细胞肺癌 (NSCLC)采用Western印迹法及免疫组化进行了神经特异性烯醇化酶 (NSE)、嗜铬粒素A(CgA)、突触素 (Syn)的检测。结果 :Western印迹法在非小细胞肺癌 (NSCLC)中检测NSE、CgA和Syn的阳性率分别为 6 3.0 %、6 5 .0 %、5 0 .0 % ,均高于免疫组化的阳性率 4 7.8%、2 6 .1%、34.7。Western印迹法和免疫组化的检测结果与肺癌的组织学类型和分化程度无明显关系。结论 :NSCLC中存在较高比例的神经内分泌分化。Western印迹法和免疫组化对诊断NSCLC中的神经内分泌分化均有重要帮助。

蛋白免疫印迹杂交法研究葛根素对成骨细胞TGF-β1及Smad2/3蛋白表达的影响

目的:观察采用蛋白免疫印迹杂交(Western Bloting)法探讨葛根素通过TGF-β1及其信号转导蛋白Smad 2/3对于促进成骨细胞增殖分化机制的研究。方法:原代培养新生小鼠成骨细胞,分别用空白对照组(含10%DMEM)及3种不同浓度分别为1μg/mL,0.1μg/mL,0.01μg/mL的葛根素干预液处理成骨细胞。采用MTT实验法检测葛根素对成骨细胞生长的影响,Western Bloting法检测葛根素对成骨细胞TGF-β1及其信号转导蛋白Smad 2/3表达的影响。结果:不同浓度的葛根素有促进成骨细胞生长的作用,并可以提高TGF-β1及其信号转导蛋白Smad 2/3的表达,呈浓度依赖性,分别与空白对照组相比有统计学意义(P<0.05)。结论:葛根素可以通过TGF-β1及Smad 2/3信号转导途径促进成骨细胞增殖与分化。

miR-9-3p对细胞脂代谢调节功能及可能机制

目的 检测microRNA-9-3p (miR-9-3p)对HepG2细胞增殖及脂质代谢的影响,探讨其对细胞沉默信息调节因子(Sirt-1)蛋白表达的影响。方法 以HepG2细胞为体外细胞模型,应用体外细胞培养技术、噻唑蓝(MTT)比色法、转染技术和Western印迹,以miR-9-3p mimic、miR-9-3p inhibitor转染为干预手段,应用MTT比色法、Western印迹检测正常对照组、miR-9-3p mimic组、anti-miR-9-3p组3组HepG2细胞增殖水平、总胆固醇(TC)及三酰甘油(TG)表达水平及Sirt-1蛋白的表达。结果 miR-9-3p mimic组miR-9-3p表达水平显著高于正常对照组(P<0.05);anti-miR-9-3p组miR-9-3p表达水平显著低于正常对照组(P<0.05);与正常对照组相比,miR-9-3p mimic组HepG2细胞增殖显著增加(P<0.05);anti-miR-9-3p组HepG2细胞增殖显著抑制(P<0.05);miR-9-3p mimic组HepG2细胞TC及TG表达水平显著增加(P<0.05);anti-miR-9-3p组HepG2细胞TC及TG表达水平显著降低(P<0.05);miR-9-3p mimic组HepG2细胞Sirt-1蛋白表达水平显著降低(P<0.05);anti-miR-9-3p组HepG2细胞Sirt-1蛋白表达水平显著增加(P<0.05)。结论 miR-9-3p转染能够促进HepG2细胞增殖;miR-9-3p转染显著增加HepG2细胞TG及TC表达;miR-9-3p转染能够显著降低HepG2细胞Sirt-1蛋白表达。miR-9-3p能够影响HepG2细胞增殖及TC及TG代谢,其可能是通过调节Sirt-1蛋白表达发挥作用。

survivin和GRIM-19在前列腺癌组织中的表达

目的:探讨survivin和GRIM-19在前列腺癌组织中的表达及意义。方法:应用免疫组化、RT-PCR和Western印迹法检测survivin和GRIM-19在正常前列腺(NP)组织、良性前列腺增生(BPH)组织和前列腺癌(PCa)组织中的表达情况。结果:免疫组化结果显示survivin在NP、BPH和PCa组织中的表达率分别为6.25%、18.18%和90.62%(P<0.01);GRIM-19的表达率分别为87.50%、81.82%和9.37%(P<0.01)。半定量RT-PCR结果显示,在NP和BPH组织未检测到survivinmRNA表达,而PCa组织可检测到survivinmRNA高表达。Western印迹结果证实,在NP和BPH组织中有微量的survivin蛋白表达;而PCa组织可检测到survivin蛋白高表达;在NP和BPH组织中GRIM-19蛋白表达强阳性,而PCa组织中只有微量表达,两者比较差异均有显著性(P<0.01)。结论:survivin和GRIM-19的表达可能与PCa的发生密切相关。

氯化甲基汞中毒大鼠周围神经损伤的病理演变

目的 :探讨氯化甲基汞中毒大鼠周围神经损伤的病理改变及病理机制。 方法 :在 WKAH大鼠服用氯化甲基汞 4mg/ d所致的亚急性汞中毒模型上 ,采用组织病理、免疫组化、蛋白印迹等方法动态观察坐骨神经和后根神经节的病理演变 ,TU NEL 染色观察细胞凋亡。 结果 :中毒后第 11天后根神经节内可见散在大型神经元 A被吞噬细胞浸润 ,电镜下 A型神经元胞质内线粒体变性 ;坐骨神经远端轻微轴索变性 ,病变逐渐加重并向心性发展。第 15天开始出现髓鞘崩解 ,MRF- 1染色显示有少量的吞噬细胞反应。第 18天出现明显轴索变性及髓鞘崩解 ,可见大量浸润的吞噬细胞 ;后根神经节内 A型神经元近于消失 ,但 B型神经元保留良好 ,B型神经元的上行终末胶状质下区亦出现明显变性。TUNEL 染色未观察到节细胞凋亡。采用Western印迹法观察到坐骨神经及后根神经节神经原纤维及髓鞘蛋白 O随中毒时间延长逐渐降低 ,在第 15天后尤为明显 ,与免疫组化结果相符合。结论 :亚急性汞中毒模型中 ,A型神经元变性可能与汞中毒损伤线粒体膜继发的能量代谢障碍有关 ;而B型神经元变性则符合逆行性死亡的过程。