用于PCR分析的小麦种子DNA微量快速提取

探索了不用液氮从小麦单粒、半粒有胚和半粒无胚中提取DNA的方法。结果表明,无论是单粒、半粒有胚和半粒无胚都能得到比较理想的DNA,DNA样品经SCAR-PCR特异标记检测,都能扩增出两条完全相同的特异条带。用无胚的半粒进行分子标记检测特别适合于对大批量早代材料目的基因的筛选。

半粒小麦种子DNA提取的研究

本研究以半粒小麦无胚种子为材料,提取DNA并进行PCR扩增检测,同时将剩下的半粒小麦有胚种子进行催芽试验.结果表明:从半粒小麦无胚种子和小麦幼叶中都能提取出质量较高的DNA;用λDNA进行浓度检测发现,小麦幼叶提取的DNA浓度高于半粒小麦无胚种子提取的DNA浓度;分别用所提取的小麦DNA作为PCR扩增模板均能够得到理想的特异条带,满足分子检测的需要;催芽试验表明,半粒小麦有胚种子也能够正常生根发芽,可作为染色体分选、原位杂交和繁殖的材料.

小麦种子规模化DNA提取及检测体系的优化

以小麦种子分子检测农业行业标准(NY/T 2859-2015)为基础,开发小麦种子快速、规模化提取DNA方法,优化反应体系中各组分含量,为小麦真实性快速执法提供技术支撑。通过对SDS、CTAB、高盐低pH、快速提取和试剂盒5种方法提取的DNA质量、浓度和PCR扩增效果进行比较,发现改进的高盐低p H方法提取种子的DNA质量、浓度能够满足小麦真实性鉴定中42对SSR引物重复鉴定的需求,是利用96孔深孔板和自动化移液工作站规模化、高通量提取DNA的较优方法。进一步优化结果显示该方法在65℃温浴条件下比室温的浓度高出25%,但两种温度条件下提取的DNA质量及浓度均能够满足品种鉴定的需求;沉淀时用0.5倍提取液体积的预冷异丙醇沉淀浓度最高,用室温的异丙醇沉淀的最佳体积是提取液体积的0.6倍。对标准中42对引物的最佳引物浓度和模板浓度均进行了优化,综合所有42对引物的优化结果发现,反应体系为20μL时,引物终浓度为0.437 5μmol/L,模板终浓度为10 ng/μL时扩增效率相对较高,扩增产物稳定,能够满足多重电泳的需求。