伪狂犬病病毒RT-qPCR检测方法的建立与应用

为建立伪狂犬病病毒(PRV)高灵敏度、超快速双重实时荧光定量PCR检测方法,根据PRV经典毒株gD和gE基因的相对保守序列设计了多组引物探针,经试验筛选出2组最优特异性引物探针,通过正交试验对反应体系中引物和探针的浓度进行优化,通过特异性、灵敏度和重复性试验评测所建立检测方法的性能.结果表明,建立的检测方法具有多重优点:高灵敏度,gD和gE基因最低检测灵敏度分别为1.06 copies/μL和1.68 copies/μL;超快速,检测时间可缩短至1 h内;特异性好,阴性对照组中常见猪患病毒均无交叉反应,PRV野毒株出现了双gD和gE基因扩增曲线,缺失gE基因的疫苗株仅出现gD基因扩增曲线;重复性强,3次重复性批内与批间试验的变异系数均低于3%.综上所述,本研究建立的双重RT-qPCR检测方法可用于PRV野毒株和疫苗株感染的快速诊断鉴别,为猪伪狂犬病(PR)的诊断及流行病学监测提供了一种快速准确的检测方法.

猪伪狂犬病毒蛋白激酶基因的序列测定与分析

对伪狂犬病毒湖北株 (PRVHB株 )蛋白激酶 (PK)基因进行了克隆和序列测定。分析比较了该序列与PRVNIA 3株、Ka株以及HSV 1、VZVPK基因的同源性。结果显示 ,在测定全长 1312bp的DNA序列中 ,包括着一个10 0 2核苷酸的开放读框 ,可编码 334个氨基酸组成的多肽。PRV HB株PK与PRV NIA3、PRV Ka、HSV 1、VZVPK基因比较 ,核苷酸的同源性分别为 98 7%、97 5 %、5 0 7%和 42 0 % ;基因编码区氨基酸序列的同源性分别为98 2 %、95 8%、37 7%和 37 2 %。PRVPK具有细胞丝氨酸 /苏氨酸蛋白激酶催化结构域的保守氨基酸共有序列和亚结构域特征序列。

猪伪狂犬病毒鲁A株TK基因的序列测定及其结构功能与进化分析

对猪伪狂犬病毒鲁A株 (PRVLA株 )TK基因进行了克隆和序列测定 ,并分析比较了该序列与PRVNIA - 3株、Ea株、SH以及HSV - 1和VZV的同源性 ,结果表明 :在全长 10 4 8bp的DNA序列中 ,包括着一个 96 3bp的开放阅读框 (ORF) ,可编码 32 0个氯基酸组成的多肽 ;在整个TK基因的ORF内 ,PRVLA株与PRVNIA - 3株、PRVEa株、PRVSH株、HSV - 1、VZV的TK基因比较 ,核苷酸的同源性分别为 98 9%、99 5 %、99 3%、36 4 %、39 1% ,氨基酸的同源性分别为 98 4 %、99 7%、98 7%、36 6 %、37 2 %。PRVLA株TK具有疱疹病毒胸苷激酶催化结构域的保守氨基酸共有序列和亚结构域特征序列。将PRV -LATK、人类和小鼠的胸苷酸激酶、人类脱氧胞苷激酶、人类腺苷酸激酶的对应于这两个亚结构域的氨基酸用DNAStar分析的进化树表明 ,疱疹病毒的TK与人类和小鼠的胸苷酸激酶的亲缘关系比与人类脱氧胞嘧啶激酶的亲缘关系更近 。

猪伪狂犬病毒野毒株与疫苗株的多重PCR鉴别

为建立一种快速鉴别猪伪狂犬病毒野毒株与疫苗株的方法,根据猪伪狂犬病毒(PRV)全基因序列,并参照SA215、Bartha-K61疫苗株基因缺失位点特征,在单一检测野毒株与疫苗株的基础上,针对g E、g B和TK基因设计引物,首次建立了同时检测猪伪狂犬病毒野毒株与疫苗株的多重PCR检测方法。通过一次PCR检测能区分感染野毒株、疫苗株SA215和Bartha-K61,且与猪圆环Ⅱ型病毒(PCV-2)、细小病毒(PPV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)和猪瘟病毒(CSFV)无交叉反应。多次试验证明该方法简单、可靠且敏感度高,可用于科学研究和临床诊断等方面。

伪狂犬病病毒野毒株与gE基因缺失疫苗株微滴数字PCR鉴别方法的建立

为建立伪狂犬病病毒(PRV)野毒株与gE基因缺失疫苗株的鉴别诊断和准确定量的微滴数字PCR(ddPCR)方法,本研究以PRV gD和gE基因为靶基因,设计并合成了2套特异性引物和Taq Man探针,建立了分别针对PRV gD和gE基因的dd PCR方法。结果显示,本研究建立的dd PCR方法能够特异性地鉴别检测PRV野毒株和疫苗株,与圆环病毒2型、猪瘟病毒、猪流感病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒等均无交叉反应;该方法针对PRV gD、gE基因的检测限分别为3.9拷贝/μL、2.3拷贝/μL,分别比相应的荧光定量PCR (qPCR)方法敏感性高10倍和5倍;针对PRV gD、gE基因的批内和批间重复性试验结果变异系数(C.V)均小于4%;通过对45份临床样品的检测,结果显示,与病毒分离方法相比,dd PCR方法敏感性为91.7%,特异性为97.2%,符合率为97.8%;与dd PCR方法相比,q PCR的敏感性为83.3%,特异性为94.3%,符合率为95.6%。本研究建立的dd PCR方法在检测低拷贝临床样品时敏感性更高、特异性强、重复性好,可以作为PRV野毒株与疫苗株的鉴别、准确定量的有效检测手段。

伪狂犬病病毒野毒株与gE基因缺失疫苗株TaqMan实时荧光定量PCR鉴别方法的建立

为实现对伪狂犬病病毒(pseudorabies virus,PRV)野毒株与gE基因缺失疫苗株的快速、敏感、特异的鉴别诊断,本试验针对PRVgD和gE基因设计了2套特异性引物和TaqMan探针,建立了PRV野毒株与gE基因缺失疫苗株的TaqMan实时荧光定量PCR鉴别方法,对引物和探针浓度、退火温度等进行了优化,对方法进行敏感性、特异性、重复性试验,并进行临床样品检测。结果显示,建立的针对gD、gE基因的TaqMan实时荧光定量PCR方法线性相关系数(R2)分别为0.996和0.980,均呈良好的线性关系;检测限分别为39.4和12.1拷贝/μL;与圆环病毒2型、猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒均无交叉反应;重复性试验结果显示,针对gD基因的批内和批间变异系数分别为1.43%~1.86%、1.10%~2.07%,针对gE基因的批内和批间变异系数分别为0.98%~1.41%、1.12%~1.86%。应用建立的TaqMan实时荧光定量PCR与普通PCR分别对11份临床疑似感染样品进行检测,阳性率分别为36.4%和27.3%。结果表明,该方法敏感性高、特异性强、重复性好,可作为伪狂犬病病毒野毒株与gE基因缺失疫苗株的早期鉴别诊断和定量检测的有效手段。

猪伪狂犬病野毒感染的临床诊断、血清学调查以及控制措施

[目的]为某规模化猪场猪伪狂犬病病毒野毒株感染防控工作提供科学的免疫防控方案。[方法]对某发病猪群(采用Bartha-K61经典毒株疫苗进行了猪伪狂犬病免疫)进行流行病学调查,并采用ELISA方法检测其猪伪狂犬病gB抗体和gE抗体水平。[结果]根据调查、解剖和血清抗体检测结果,初步确诊该发病猪群为猪伪狂犬病野毒感染。通过采取紧急免疫伪狂犬病HB2000毒株疫苗、调整免疫程序和配合药物治疗等措施,育肥猪死亡率从2.56%降低至0.60%;除了4周龄及12周龄猪群外,其余猪群伪狂犬病野毒抗体水平全部下降;种公猪、8周龄、10周龄、14周龄猪群伪狂犬病野毒抗体阳性率均为0。[结论]Bartha-K61经典毒株疫苗并不能提供完全的保护力,通过紧急免疫与流行毒株同源性较高的HB2000毒株疫苗,加强生物安全管理工作,能够有效控制猪伪狂犬病野毒感染。