Wortmannin通过抑制癫痫大鼠海马自噬活性发挥神经保护作用

目的:探讨癫痫大鼠海马自噬活性的变化及自噬抑制剂wortmannin(WM)对致痫大鼠海马神经元的保护作用。方法:实验大鼠分为对照组、致痫2 h、8 h、16 h、24 h、72 h组和WM干预组。应用HE染色和Nissl染色观察癫痫大鼠海马神经元损伤的变化。免疫印迹检测海马组织微管相关蛋白1轻链3(LC3)Ⅱ/LC3Ⅰ的比值作为自噬活性的指标。结果:LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值在大鼠癫痫发作2 h时开始升高,24 h达到高峰,持续升高至少72 h。致痫24 h时海马CA1区出现明显神经元损伤和丢失。WM干预组CA1区存活神经元数目(100.88±18.73)显著高于癫痫组(70.16±5.09)(P<0.05),LC3Ⅱ/LC3Ⅰ的比值低于癫痫组(P<0.05)。结论:癫痫发作导致的海马损伤时存在自噬激活现象;WM通过抑制自噬活性减轻癫痫发作所致的海马损伤,具有神经保护作用。

wortmannin对重症急性胰腺炎大鼠胰肝损伤的保护作用

目的探讨wortmannin预处理对重症急性胰腺炎(SAP)大鼠肝损伤的保护作用及其可能机制。方法健康成年SD大鼠54只,随机分为对照组(C组)、SAP组(P组)和SAP+wortmannin组(PW组),每组18只。除C组以生理盐水代牛磺胆酸钠外,另两组逆行胆胰管注射50g/L牛磺胆酸钠制备SAP模型。各组分别于术后3,6,12h检测血清中TNF-α,ALT,AST水平及肝组织中NF-κB活性,观察肝组织及胰腺组织的病理变化。结果P组血清中TNF-α,ALT,AST水平及肝组织中NF-κB活性(积分灰度)均显著高于C组(P<0.01);胰腺、肝组织病理损伤随病情进展而逐渐加重。PW组较C组各项指标均升高,但较P组明显降低(P<0.01);且胰腺、肝组织病理损伤亦较P组减轻。结论wort-mannin预处理对SAP大鼠胰肝损伤有一定的保护作用,其机制可能与其抑制了NF-κB的活化、减少TNF-α等多种炎症因子的释放有关。

Wortmannin对胰腺癌细胞增殖和生存的影响

目的:观察Wortmannin对胰腺癌PANC-1、CFPAC-1细胞株增殖、凋亡的影响,探讨Wortmannin抗肿瘤的作用机制。方法:采用噻唑盐比色法(MTT)、平板克隆试验、流式细胞分析测定Wortmannin对PANC-1、CFPAC-1细胞增殖、凋亡的影响。结果:用不同浓度Wortmannin培养CFPAC-1细胞24、48、72h后,其最大增殖抑制率分别为:10.6%、30.3%、18.9%(P<0.05),且呈明显的计量依赖效应,而Wortmannin对PANC-1细胞无明显抑制作用。Wortmannin可明显抑制CFPAC-1细胞克隆的形成(P<0.01),对PANC-1细胞克隆形成也有一定的抑制作用(P<0.05)。但Wortmannin对两株细胞均无诱导凋亡的作用。结论:Wortmannin通过阻断PI3K/Akt信号通路抑制胰腺癌细胞株增殖,达到抗肿瘤的作用;不同的细胞系对Wortmannin的敏感性不同。

PI3K特异性抑制剂Wortmannin和APP17肽对SY5Y细胞胰岛素信号转导通路的作用

目的利用PI3K的特异性抑制剂Wortmannin阻断体外培养的人神经母细胞瘤株SY5Y细胞的存活信号转导通路,观察β淀粉样肽前体蛋白(APP)17肽对SY5Y细胞生长的影响及其作用机制。方法体外培养SY5Y细胞,分为对照组、Wortmannin组、APP17肽组、APP17肽+Wortmannin组、葡萄糖组、葡萄糖+APP17肽组、葡萄糖+Wortmannin+APP17肽组,观察各组细胞的噻唑蓝(MTT)代谢率、乳酸脱氢酶(LDH)漏出率、细胞轴突长度、胞体面积。结果(1)APP17肽可促进SY5Y细胞MTT代谢率升高、LDH漏出率降低、细胞轴突长度和胞体面积增加,但经Wortmannin作用后,其作用减弱。(2)APP17肽对高糖环境下的SY5Y细胞也有上述作用,且经Wortmannin作用后其作用减弱。结论APP17肽能通过激活胰岛素的PI3K信号转导通路发挥其神经保护作用。

Wortmannin对凝血酶诱导的人血小板聚集和磷脂酰肌醇三磷酸累积的影响

Ｗ ｏｒｔｍ ａｎｎｉｎ 是肌醇磷脂３激酶的不可逆抑制剂．用比浊法分析血小板聚集；肌醇磷脂用３２ Ｐ磷酸钠标记，用氯仿和甲醇抽提，用 Ｔ Ｌ Ｃ和放射自显影分析，研究了 Ｗ ｏｒｔｍ ａｎｎｉｎ 对凝血酶诱导的人血小板聚集和磷脂酰肌醇三磷酸（ Ｐ Ｉ Ｐ３）累积的影响．结果显示， Ｗ ｏｒｔｍ ａｎｎｉｎ 对凝血酶（５００ Ｕ／ Ｌ）诱导的人血小板聚集有抑制作用，这种抑制作用在一定范围内呈剂量依赖关系（２０～８０μｍ ｏｌ／ Ｌ）．凝血酶（５００ Ｕ／ Ｌ）诱导人血小板 Ｐ Ｉ Ｐ３ 的累积， Ｗ ｏｒｔｍ ａｎｎｉｎ 对此累积有抑制作用，这种抑制作用在一定范围内呈剂量依赖关系（４０～１６０ μｍ ｏｌ／ Ｌ）．结果提示： Ｗ ｏｒｔｍ ａｎｎｉｎ 可能是潜在的抗血小板药物，抑制凝血酶诱导的人血小板聚集主要与其抑制 Ｐ Ｉ Ｐ３ 的累积有关．结果也提示，肌醇磷脂３激酶在血小板活化中起重要作用．

脑室预注射Wortmannin对沙土鼠海马缺血耐受的影响

目的:探讨磷脂酰肌醇-3(羟基)激酶(PI-3K)与沙土鼠海马缺血耐受的关系。方法:沙土鼠24只,随机分为A(2min缺血组)、B(5min缺血组)、C(2min缺血+5min缺血组)、D(假手术组)、E(脑室预注射PBS组)、F(脑室预注射Wortmannin组)6组,每组4只。TUNEL法检测海马CA1区锥体细胞凋亡。结果:B组锥体细胞凋亡数较A、C、E3组显著增多,F组凋亡细胞数较C组明显增多。D组未见明显凋亡细胞。结论:脑室预注射Wortmannin可抑制海马CA1区的缺血耐受现象,PI-3K可能参与介导了沙土鼠海马缺血耐受。

H89和wortmannin对霍乱毒素促进远端视神经损伤后视网膜节细胞再生的影响

目的:探讨H89和wortamnnin对霍乱毒素(CTx)促进成年金黄地鼠远端视神经受损后视网膜节细胞(RGCs)再生的影响。方法:远端切断视神经并对接一段自体坐骨神经(AG),玻璃体内注射CTx及H89、wortman—nin。动物随机分为AG组;AG+CTx组;AG+CTx+H89组;AG十CTx+wortmannin组,4 w后粒蓝逆行标记再生的RGCs,荧光显微镜下观察计数。结果:AG十CTx组再生的视网膜节细胞平均数(43.2)明显高出AG组(2.6),AG+CTx+H89组平均再生数为3.2,与AG组相近,明显低于AG+CTx组。AG+CTx+W组平均再生数为9.6,明显高于AG组,低于AG+CTx组。结论:H89和wortmannin可部分抑制CTx对视神经远端切断后视网膜节细胞再生的促进作用。

wortmannin对重症急性胰腺炎大鼠肺损伤的保护作用

目的:观察磷脂酰肌醇-3激酶(PI3K)抑制剂wort-mannin对重症急性胰腺炎(SAP)大鼠肺损伤的保护作用并探讨其机制.方法:将健康成年SD大鼠54只随机分为对照组、SAP组和SAP+wortmannin组,每组18只,逆行胆胰管注射50g/L牛磺胆酸钠制备SAP模型.检测血清TNF-α水平、肺组织湿/干质量比值、肺组织髓过氧化物酶(MPO)活性、支气管肺泡灌洗液(BALF)蛋白含量;观察肺组织及胰腺组织的病理变化.结果:SAP组较对照组血清TNF-α水平、肺组织湿/干质量比值、BALF蛋白含量及肺组织MPO活性均显著升高(P<0.01),胰腺、肺组织病理损伤随病情进展而逐渐加重;SAP+wortmannin组较对照组各项指标均升高,但较SAP组均明显降低(P<0.01),胰腺、肺组织病理损伤较SAP组减轻.结论:wortmannin对SAP大鼠肺损伤有一定的保护作用,其机制可能与其抑制了中性粒细胞内PI3K信号转导通路的活化,使多种炎症细胞的活化和TNF-α等炎症因子的释放受到抑制有关.

H-89和wortmannin对forskolin和IBMX促进受损视网膜节细胞再生作用的影响

目的 探讨forskolin和IBMX促进受损视网膜节细胞 (RGCs)再生的作用机制。 方法 采用荧光逆行示踪标记术和自体坐骨神经移植术 ,研究蛋白激酶A(PKA)抑制剂H 89或 /和PI3 K特异抑制剂wortmannin玻璃体内注射对forskolin和IBMX促进成年金黄地鼠受损RGCs再生的影响。结果 H 89和wortmannin均可部分抑制forskolin和IBMX对受损RGCs的促再生作用 ,wortmannin的抑制作用更大 ;两药联合应用 ,可完全抑制forskolin和IB MX对受损RGCs的促再生作用。 结论 forskolin和IBMX可能是通过PKA CREB和PI3 K

Wortmannin对急性肺损伤小鼠肺组织IL-6和IL-10表达的影响

目的研究Wortmannin对急性肺损伤模型小鼠肺组织白介素-6(IL-6)和白介素-10(IL-10)表达的影响。方法30只昆明小鼠随机分为正常对照组、急性肺损伤组和Wortmannin处理组。采用腹腔注射LPS(10 mg/kg)建立小鼠急性肺损伤模型,对照组腹腔注射同体积的生理盐水,Wortmannin处理组则于造模前2 h腹腔注射Wortmannin(1.4 mg/kg)。LPS注射后6 h处死大鼠,计算肺组织湿/干重(w/D)比值,Western blot方法检测三组小鼠肺组织内IL-6和IL-10的表达变化,RT-PCR方法检测三组小鼠肺组织内IL-6 mRNA和IL-10 mRNA的表达变化。结果急性肺损伤组小鼠肺组织IL-6蛋白表达显著上升,平均光密度值为(0.38±0.03),显著高于正常对照组的表达(0.09±0.01),P<0.05;相比于急性肺损伤组小鼠,Wortmannin处理组小鼠肺组织IL-6蛋白表达显著降低,光密度值为(0.21±0.02),P<0.05;急性肺损伤组小鼠肺组织IL-10蛋白表达显著降低,平均光密度值为(0.11±0.01),显著低于正常对照组的表达(0.21±0.01),P<0.05;相比于急性肺损伤组小鼠,Wortmannin处理组小鼠肺组织IL-10蛋白表达显著升高,光密度值为(0.18±0.02),P<0.05。RT-PCR方法检测三组小鼠IL-6mRNA时发现,Wortmannin处理组小鼠肺组织IL-6 mRNA的平均光密度值为(0.37±0.03),显著低于急性肺损伤组小鼠肺组织IL-6 mRNA的的平均光密度值为(0.26±0.02),P<0.05;RT-PCR方法检测三组小鼠IL-10mRNA时发现,Wortmannin处理组小鼠肺组织IL-10 mRNA的平均光密度值为(0.27±0.02),显著高于急性肺损伤组小鼠肺组织IL-10 mRNA(0.18±0.02)的表达,P<0.05。结论 Wortmannin能抑制急性肺损伤小鼠肺组织IL-6表达,上调IL-10的表达。

PKB在人上皮性卵巢癌中的表达及P13K抑制剂Wortmannin对细胞增殖的影响

目的检测蛋白激酶B(PKB)在上皮性卵巢癌组织中的表达,以及磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)特异性抑制剂wortmannin对卵巢癌细胞株CAOV3细胞增殖的影响,探讨PI3K/PKB信号传导通路在卵巢癌发生发展中的意义。方法应用RT-PCR和western印迹方法对50例上皮性卵巢癌组织PKB的表达进行了分析。通过MTT比色法,观察wortmannin对卵巢癌细胞增殖的影响。流式细胞仪测定wortmannin对细胞周期的影响。结果PKBmRNA在上皮性卵巢癌组织中表达,与正常卵巢、卵巢瘤样病变及卵巢良性肿瘤相比,无显著差异(P>0.05);western印迹检测见上皮性卵巢癌组织中磷酸化PKB蛋白条带深于正常卵巢、卵巢瘤样病变及卵巢良性肿瘤组织,量化后比较差异显著(P<0.05),且在Ⅲ～Ⅳ期卵巢癌中的表达水平明显高于Ⅰ～Ⅱ期(P<0.0 5)。加入wortmannin后,CAOV3细胞株增殖比明显下降,其增殖下降程度与wortmannin浓度呈显著正相关,在wortmannin的作用下,由GO+G1期进入S和G2+M期的细胞明显减少,并在一定浓度范围内成剂量依赖性,与对照组比较,差异显著。结论磷酸化PKB蛋白与上皮性卵巢癌的发生、发展、浸润呈正相关,wortmannin可有效阻滞此传导途径。

Wortmannin对表皮生长因子诱导的血管平滑肌细胞增殖及迁移的影响

目的:研究PI3K抑制剂Wortmannin对表皮生长因子(EGF)诱导的大鼠血管平滑肌细胞(VSMCs)增殖、迁移及磷酸化Akt蛋白表达的影响,旨在探讨EGF诱导的VSMCs增殖和迁移的信号通路。方法:以低血清培养的VSMCs作为对照,采用细胞计数、划痕损伤实验和WesternBlotting技术,观察Wortmannin对EGF诱导的VSMCs增殖、迁移及磷酸化Akt蛋白表达的影响。结果:干预后24h,EGF组VSMCs增殖、迁移较对照组明显增强,同时磷酸化Akt蛋白的表达平行增高。而Wortmannin则明显抑制了VSMCs的增殖、迁移和磷酸化Akt蛋白的表达。结论:PI3K/Akt信号通路参与了EGF诱导的VSMCs增殖和迁移。

Wortmannin和U0126抑制胰岛素对大鼠骨骼肌成肌细胞的促分化作用

目的观察wortmannin和U0126抑制胰岛素对大鼠成肌细胞向成熟肌细胞分化作用,探索定向诱导肌分化的途径及其分子机制。方法分离和培养大鼠骨骼肌成肌细胞,用含不同浓度胰岛素的DMEM培养基培养,收集细胞,在相差显微镜下观察形态变化,并通过免疫细胞化学方法和Western blot法检测生肌素(myogenin)表达。用磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)特异性抑制剂wortmannin和MEK特异性抑制剂U0126干预后,观察胰岛素对骨骼肌成肌细胞分化的影响。结果胰岛素能明显促进骨骼肌成肌细胞形成肌小管,诱导2 d开始有肌管形成并逐渐增多到7 d达到高峰;胰岛素促进骨骼肌成肌细胞的生肌素阳性细胞核和生肌素蛋白表达增多,而wortmannin和U0126能下调胰岛素的这种作用。结论 Wortmannin和U0126可阻断胰岛素促进骨骼肌成肌细胞向成熟肌细胞分化,使肌管生成减少,生肌素表达下调。

Wortmannin和LiCl对AML细胞系Hedgehog/gli通路的调节作用

目的:研究通路阻断剂Wortmannin和LiCl对急性髓细胞白血病细胞系Hedgehog/gli通路的调节作用。方法:选取HL-60和K562细胞系,采用Western blot方法检测gli1和gli2蛋白表达,定量PCR检测gli1和gli2 mRNA的变化,WST-1检测不同通路阻断剂联合对细胞增殖的抑制作用。结果:Wortmannin和LiCl均可以上调两细胞系中gli蛋白和mRNA的表达,并可减弱gli阻断剂GANT61对AML细胞系的毒性作用。结论:Wortmannin和LiCl可以上调AML细胞系中Hedgehog通路的表达。

WORTMANNIN的辐射增敏与NF-kB相关

用凝胶迁移实验(Electrophoretic mobility shift assay,EMSA)研究PI-3K的特异性抑制剂WORTMANNIN(WT)影响细胞辐射反应与核因子NF-kB的关系。合成含kB位点的双链寡核苷酸碱基序列,以无菌双蒸水稀释,退火,制备放射性核苷酸探针。常规方法培养LP3细胞,实验LP3细胞样品受WT作用及5Gyγ射线照射后,提取核蛋白,与标记探针进行结合反应,进行非变性聚丙烯酰氨凝胶电泳。真空干胶,低温环境中进行放射自显影,照相扫描,进行转录因子的凝胶迁移率改变分析。未受WT作用的LP3细胞转录因子NF-kB结合活性在受5Gyγ射线照后6h内,经历从8%升高至50%然后降低至12%,50μmol/L WT明显抑制了转录因子受照后的变化幅度。电离辐射可能通过一些信号传导途径激活NF-kB,进而促使一些与DNA损伤修复和细胞其它防御机制有关的基因活动,以减轻辐射损伤,WT有可能是通过阻滞这一过程的早期阶段而发生辐射增敏效应。

Wortmannin抑制PI3-K途径对K562及NB4细胞增殖的影响

目的 :为探讨Wortmannin抑制磷酰肌醇 - 3激酶 (PI- 3K)途径对K5 62 ,NB4细胞增殖的影响 ,探寻慢性髓细胞性白血病 (CML)的治疗新途径 .方法 :用磷酰肌醇 - 3激酶 (PI - 3K)特异抑制剂Wort mannin抑制PI - 3K活性 ,观察慢性髓细胞性白血病细胞系K5 62细胞和急性早幼粒细胞性白血病细胞系NB4细胞在 2 4,48,72h增殖能力的变化 .t检验统计分析 .结果 :K5 62和NB4细胞在 2 4,48,72h的增殖抑制率分别为 3 4 67% ,5 7 46% ,65 85 %和 2 6 2 9% ,5 5 1% ,2 10 % .集落形成实验以GM -CSF为主要生长刺激物的培养体系在 3 7℃ ,5 %CO2 孵箱培养 14d后细胞系的集落数和集落形成率分别为K5 62 :80 75±10 2 4和 16 15 % ,K5 62 +WT :3 8 0 0± 12 75和 7 60 % ,NB4:2 9 5 0± 5 97和 5 90 % ,NB4+WT :3 0 5 0± 5 74和 6 10 % .集落形成抑制率为 :5 2 94%和 3 3 9% .结论 :Wortmannin可显著抑制K5 62细胞的增殖和集落形成 ,而对NB4细胞无明显影响 (P均 <0 0 5 ) .Wortmannin可以通过抑制PI - 3K通路抑制K5 62细胞的增殖 。

P13K特异性抑制剂Wortmannin对APP17肽信号传导通路的影响

目的：利用P13’K的特异性抑制剂Wortmannin阻断SY5Y细胞信号转导通路，观察APP17肽对SY5Y生长的影响，探讨APP17肽的作用机制。方法：体外培养SY5Y细胞，分为对照组、Wortmannin组（3μmol／L）、APP17肽组（30μmol／L）、APP17肽加Wortmannin组、11．5mmol／L葡萄糖组、葡萄糖加APP17肽组、葡萄糖加Wortmannin加APP17肽组，每组8～12孔。观察MTT代谢率、LDH漏出率、细胞轴突长度、胞体面积，进行统计学分析。结果：1．APP17肽可使SYSY细胞MTT代谢率升高、LDH漏出率降低、SYSY细胞轴突长度和胞体面积增加，经Wortmannin作用后，其作用减弱。

Wortmannin抑制Wnt/β-Catenin通路对猪卵巢颗粒细胞发育的影响

为探究PI3K通路与Wnt/β-Catenin通路在猪卵巢颗粒细胞发育中的互作关系以及调控功能,以不同浓度(DMSO,0.1,1,1.5,3,5μM)PI3K通路抑制剂Wortmannin处理体外培养猪卵巢颗粒细胞48h,CCK-8法检测猪卵巢颗粒细胞细胞活力,Western Blot法检测β-Catenin蛋白水平;5μMWortmannin处理体外培养猪卵巢颗粒细胞48h,实时定量PCR检测猪卵巢颗粒细胞内类固醇生成、激素受体和细胞凋亡相关基因的表达。结果表明,Wortmannin处理猪卵巢颗粒细胞可抑制颗粒细胞细胞增殖活力,其中3μM和5μMWortmannin,相对其他处理组,显著地(P<0.05)降低细胞增殖活力;对应的,不同浓度的Wortmannin也阻遏Wnt/β-Catenin通路,对比其他组,3μM和5μMWortmannin处理组抑制效果最显著(P<0.05);实时定量PCR检测结果表明,5μMWortmannin处理显著下调猪卵巢颗粒细胞CYP19A1(P<0.001)和CYP11A1(P<0.01)mRNA水平,抑制激素受体基因FSHR和LHCGR基因表达(P<0.05),促进Caspase3(P<0.05)和PTSG2(P<0.01)表达。综上所述,Wortmannin抑制猪卵巢颗粒细胞Wnt/β-Catenin通路,诱导细胞活力下降,促进细胞凋亡,并且阻碍激素受体表达和类固醇激素合成。

Wortmannin增强细胞辐射敏感性的分子机制

Ｗ ｏｒｔｍ ａｎｎｉｎ（ Ｗ Ｏ Ｒ Ｔ）是 Ｐ Ｉ３ Ｋ 家族激酶特异抑制剂，对 ｐ５３ 野生型及突变型细胞的辐射敏感性均有提高．为了阐明 Ｗ Ｏ Ｒ Ｔ 的辐射增敏机制，通过免疫沉淀及免疫印迹法分析了 Ｗ Ｏ Ｒ Ｔ对辐射引起的细胞 Ｇ２／ Ｍ 转换中关键分子 ｃｄｃ２ 酪氨酸脱磷酸化延迟的影响；通过流式细胞术分析了 Ｗ Ｏ Ｒ Ｔ 对辐射引起的细胞 Ｇ２ 期延迟、细胞凋亡的影响；经报告基因转染的方法分析了 Ｗ Ｏ Ｒ Ｔ对宿主细胞对辐射损伤报告基因修复的影响；发现 Ｗ Ｏ Ｒ Ｔ 可促进受照细胞 ｃｄｃ２ 酪氨酸脱磷酸化、减弱辐射引起的细胞 Ｇ２ 期延迟、增强细胞凋亡并抑制损伤 Ｄ Ｎ Ａ 修复．提示 Ｗ Ｏ Ｒ Ｔ 辐射增敏是通过干扰细胞 Ｇ２ 期检查点调控、抑制损伤 Ｄ Ｎ Ａ 修复和促进细胞凋亡等多种途径实现的．

Wortmannin对糖尿病肾病大鼠肾组织TNF-α与VEGF表达的影响

目的研究糖尿病肾病(DN)大鼠模型经静脉注射PI3K抑制剂Wortmannin后肾组织肿瘤坏死因子-α(TNF-α)与血管内皮生长因子(VEGF)表达的变化。方法成年健康清洁级SD雄性大鼠30只,随机分为假手术组(10)、模型组组(10)和Wortmannin处理组。参照Anderson′s方法制作糖尿病肾病大鼠模型。采用Western blot方法检测三组大鼠肾组织TNF-α与VEGF蛋白的表达;RT-PCR方法检测三组大鼠肾组织TNF-αmRNA与VEGFmRNA的表达。结果 Western blot结果显示,模型组与Wortmannin处理组肾组织TNF-α与VEGF蛋白的表达量均显著高于假手术组(P<0.05),而与模型组相比,Wortmannin处理组肾组织TNF-α与VEGF蛋白的表达量明显降低(P<0.05);RT-PCR结果显示,与假手术组比较,模型组与Wortmannin处理组肾组织TNF-αmRNA与VEGFmRNA的表达量均显著升高(P<0.05),而Wortmannin处理组肾组织TNF-αmRNA与VEGFmRNA的表达则明显低于模型组(P<0.05)。结论 PI3K抑制剂Wortmannin能够下调DN大鼠肾组织TNF-α与VEGF的表达。