候选基因策略在植物遗传学中的应用

随着遗传学研究技术的快速发展和后基因组学时代的来临,候选基因的概念和研究方法越来越多地被人们所应用,成 为功能克隆、图位克隆、表型克隆、插入突变等方法之外的又一重要基因克隆策略。候选基因策略的基本原理和主要步骤,以 及其在植物遗传学中具有重要的应用实例。

wt1定量联合FCM在急性髓细胞白血病MRD监测中的临床应用

目的探讨在急性髓细胞白血病(AML)中Wilms瘤基因1(wt1)mRNA定量联合多参数流式细胞术(FCM)分析监测微小残留病灶的临床应用。方法采用实时荧光定量聚合酶链反应技术(qRT-PCR)检测35例AML患者的wt1表达水平;将患者根据不同亚型分组检测;并且对9例缓解和4例复发患者进行随访,检测wt1表达水平。采用FCM分析AML中微小残留病灶(MRD)水平。结果与对照组比较,AML病例组wt1表达水平明显增高,差异有统计学意义(P<0.05)。在初诊的各种AML亚型中,M2亚型wt1表达水平最高,M6亚型wt1表达水平最低。9例随访患者提示在达到完全缓解时wt1表达水平下降,而4例随访复发患者在复发时再次升高。FCM检测MRD在不同阶段异常髓系细胞比例明显不同。联合qRT-PCR和FCM技术对MRD检测的敏感性和特异性大大提高,两者具有一致性;利用ROC曲线对复发病例进行分析得到的监测阈值为3.33%。结论在急性髓细胞白血病中wt1 mRNA定量联合多参数流式细胞术分析可用于监测MRD、评估治疗效果、预后及预测疾病复发风险。

Wt1基因与Ph^＋白血病细胞系K562的生物学特性

Wt1基因是与造血调控、白血病发生及治疗预后密切相关的双功能基因,在急性髓系白血病及慢性粒细胞白血病进展期呈高表达,且与预后呈负相关,已用于临床微量残留病的监测。WT1蛋白不同亚细胞定位发挥不同生物学功能。本研究旨在探讨Ph+白血病细胞系K562中wt1 mRNA及蛋白的表达与定位,wt1抑制剂——姜黄素(curcumin)对K562细胞的增殖及细胞周期的影响及wt1在白血病发生发展中的相关作用机制。采用MTT法检测细胞增殖情况;流式细胞术分析细胞周期改变;免疫荧光技术及Western blot观察WT1蛋白的亚细胞定位及药物处理后表达水平的变化;实时定量PCR法观察药物处理后wt1及bcr/ablp210转录本水平的变化。结果表明,wt1 mRNA及蛋白在K562细胞高表达,姜黄素及格列卫均能降低wt1 mRNA及蛋白的表达水平,抑制细胞增殖;姜黄素使K562细胞停滞于G2/M期,而格列卫使其停滞于G0/G1期。结论:wt1基因表达改变可以影响Ph阳性细胞—K562的生长、增殖,调控wt1表达有可能成为Ph阳性白血病的新的治疗策略。

急性髓系白血病患者白血病干细胞WT1基因表达水平及其临床意义

目的探讨急性髓系白血病（AML）患者WT1基因高表达是否发生在白血病干细胞（LSC）阶段及其意义。方法采用流式细胞术分选AML患者CD34^＋CD38^-CD123^＋细胞，实时荧光定量RT—PCR方法检测其总WT1、＋17AA、＋KTS异构体的表达，计算出WT1（＋／＋）、WT1（＋／-）、WT1（-／＋）、WT1（-／-）四种异构体的比例，并与来源于正常人和AML患者骨髓的CD34^＋CD38^-CD123^-干细胞比较；同时分析AML患者LS CWT1表达水平与缓解率、生存期的关系。结果AML患者骨髓CD34^＋CD38^-CD123^＋细胞WT1相对表达水平最高（0．034±0．034），AML患者骨髓CD34^＋CD38^-CD123^-细胞群表达次之，来源于正常人的骨髓CD34^＋CD38^-CD123^＋细胞表达最低，三组之间比较差异有统计学意义（P〈0．05）；三群细胞中均以＋17AA为主，组间比较差异无统计学意义。＋KTS异构体比例在正常干细胞中最高，为0．57±0．04，在AML患者CD34^＋CD38^-CD123^-细胞群中所占比例最低，为0．50±0．12，两组比较差异有统计学意义（P〈0．05）；三种细胞群中四种异构体的表达比例各组之间比较差异无统计学意义（P〉0．05），均以WT1（＋／＋）为主，WT1（-／-）最少。CD34^＋CD38^-CD123^＋ LSC中WT1表达水平与患者性别、年龄、FAB分型及骨髓中原始细胞比例无明显相关性，但AML患者WT1高表达组原始细胞群CD34^＋细胞比例明显高于WT1低表达组（P〈0．01）。WT1高表达组患者CR率为21．1％，低表达组CH率为59．1％，差异有统计学意义（P〈0．05）。对41例患者跟踪随访118（3～290）d，WT1 mRNA高表达组中位生存时间77[95％可信区间（ci）45～108]d，较低表达组中位生存时间158（95％CI100～215）d短，差异有统计学意义（P=0．041）。结论AML患者WT1高表达发生于LSC阶段，其异构体比例与正常干细胞比较差异无统计学意义。干细胞阶段WT1高表达常导致患者缓解率低、生存期短。