StaphPlex结合xMAP技术用于血培养快速检测葡萄球菌及其耐药基因

目的探讨StaphPlex技术从血培养中快速鉴定葡萄球菌及其相关耐药基因的临床应用价值。方法用StaphPlex结合xMAP技术对含革兰阳性球菌(GPC)的血培养阳性标本作葡萄球菌鉴定及其耐药基因的分析,并与常规表型鉴定和药物敏感试验结果进行比较。用StaphPlex和实时荧光定量PCR技术分别对4株耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)进行SCCmec及PVL基因检测。结果从23份GPC标本中快速鉴定出葡萄球菌21株(91.3%),非葡萄球菌2株(8.7%)。经细菌表型鉴定,2株非葡萄球菌1株为屎肠球菌,另1株为头状葡萄球菌。StaphPlex技术检测aacA、ermA、ermC、SCCmec和PVL基因结果与体外药物敏感试验及实时荧光定量PCR一致性良好。结论 StaphPlex技术是一种快速准确检测血培养中葡萄球菌及其耐药基因的新技术,有较好的临床应用价值。

采用xMap技术检测肺癌患者外周血单个核细胞microRNA的表达变化及其意义

目的探讨外周血单个核细胞中microRNA(miRNA)在肺癌患者和正常对照者中的差异及其临床意义。方法采用RNA-DNA嵌合探针,利用液态芯片(xMap)技术检测30例肺癌患者治疗前和30例正常对照者外周血单个核细胞中miR-20a、miR-21、miR-31、miR-126、miR-145、miR-222、miR-372的表达量。结果肺癌患者外周血单个核细胞中miR-145、miR-20a、miR-222、miR-21、miR-372高于正常对照者,差异有统计学意义(P<0.05)。结论利用RNA-DNA嵌合探针,采用xMap检测技术,能准确快速地检测肺癌患者外周血单个核细胞中miRNA,其表达的变化可能与肺癌的发生、发展有密切关系,对肺癌的早期诊断可能有一定价值。

多重快速鉴别病原微生物的新技术:xMAP液态芯片

多指标同步分析（Flexible Multi-Analyte Profiling,xMAP）液态芯片技术是美国Luminex公司近年来开发的一种新型生物芯片技术。这种基于微球的芯片技术能够对单孔内多达100种不同的反应同时进行检测,与固相芯片或片膜芯片相比,具有多重、快速、灵敏度高（可达0.01pg）、重复性好（CV〈5%）以及检测动态范围宽（可达0.2～32000pg/ml）等优点。目前,该技术已被广泛应用于各研究领域,尤其在核酸、蛋白质和其他生物分子的大规模分析中。

诊断急性呼吸道感染的新方法：Luminex xMAP~·技术

急性呼吸道感染（ARTI）是最常见的传染病。在美国,仅季节性流感每年至少造成约36 000人死亡,成为致死的第四大原因。目前常用的病毒培养、直接免疫荧光法（DFA）、免疫层析法及定量PCR等方法中,无一种方法能够及时检测出导致ARTI发生的主要病毒种类。由Luminex公司研制的xTAG呼吸道病毒诊断试剂盒（RVP）填补此项空缺,已经通过美国FDA认证。该试剂盒同时保证高敏感性及高特异性,xMAP技术是其核心技术。

常见7种食源性致病菌xMAP液相芯片快速筛查方法的建立及应用

目的采用xMAP液相悬浮芯片检测方法,建立一管同时检测金黄色葡萄球菌、沙门菌、副溶血弧菌、单增李斯特菌、大肠杆菌O157∶H7、创伤弧菌和空肠弯曲菌的快速筛查方法。方法根据GenBank公布的金黄色葡萄球菌肠毒素nuc基因、沙门菌侵袭性基因ssaR、副溶血弧菌通用基因toxR、单增李斯特菌的hlyA基因、大肠杆菌O157∶H7的rfbE基因、创伤弧菌的vvh基因和空肠弯曲菌的gyrA基因,设计特异性引物和探针,利用上游引物和生物素标记的下游引物对7个靶序列进行不对称实时PCR扩增,7重实时PCR扩增产物和制备的7种偶联探针的微球在同一体系中进行杂交,最后利用藻红蛋白和生物素的亲和作用报告荧光,从而建立7种食源性致病菌的xMAP液相悬浮芯片检测法。结果 xMAP液相悬浮芯片体系检测140株菌株,均出现特异性荧光中值信号,7种食源性致病菌检测互不干扰。DNA和菌液检出限分别为1～100ng和105～108cfu/ml对56份各类食品标本进行检测,检出金黄色葡萄球菌2份、沙门菌4份、副溶血弧菌7份、单增李斯特菌1份、创伤弧菌3份,未检出大肠杆菌O157∶H7和空肠弯曲菌,此结果与传统方法分离结果相一致。结论xMAP液相悬浮芯片技术从样品处理到检测结果需3.5h左右,该方法可应用于食品安全风险监测中食源性致病菌的快速筛查和食源性致病菌的分型鉴定。

应用xMAP液态芯片多重快速检测四种病原微生物的研究

目的:建立一种多重、快速、特异性好、灵敏度高的病原微生物检测方法。方法:根据GenBank数据库中的小肠结肠炎耶尔森氏菌、单核细胞增生性李斯特菌、产气荚膜梭菌、鼠疫耶尔森氏菌基因序列,分别针对ail、hly、cpe、3a基因设计4对引物和4条探针。通过重叠PCR扩增各目的基因并构建重组质粒,以该重组质粒DNA为模板,通过多重PCR同时扩增上述4个基因,建立xMAP液态芯片检测技术,在此基础上对标准菌株基因组DNA进行检测并验证该方法的特异性和敏感性。结果:xMAP液态芯片对质粒DNA和标准菌株基因组DNA的检测结果与多重PCR结果一致。该方法能在3.5 h内同时完成对4种病原菌的检测,特异性好,且敏感性要高于PCR方法,灵敏度最高可达200CFU/ml。结论:xMAP液态芯片技术是病原微生物的多重快速检测的新方法,具有很好的应用价值和前景。

应用Luminex xMAP液相芯片技术研究miRNAs对THP-1细胞产生细胞因子的影响

目的研究let-7e单独作用或miR-106b和miR-20a共同作用对THP-1细胞产生细胞因子的影响。方法用Cy3标记的miRNA阴性对照瞬转THP-1细胞24h、36h和48h，免疫荧光法检测其转染效率；let-7e、miR-106b及miR-20amimic分别瞬转THP-1细胞24h、36h和48h，qRT—PCR检测各miRNA表达量并筛选各miRNA的最佳转染时间；1mg／L LPS刺激各miRNA转染的THP-1细胞1h后，Luminex xMAP液相芯片技术检测THP-1细胞产生的IL-8、干扰素诱导蛋白-10（IP-10）、单核细胞趋化蛋白-1（MCP—1）、IL-1d、IL-6、IL-10、TNF-α、IFN-α和IFN—β，并进行差异性分析。结果转染后90％以上的THP-1细胞带有红色荧光；let-7e mimic的最佳转染时间是48h，miR-106b及miR-20amimic的最佳转染时间是24h；相对于各自的对照组，let-7e mimic组IL-8、IP-10和MCP-1表达量增加，而在miR-106b和miR-20a mimic共转染组各趋化因子表达量减少。结论let-7e促进THP-1细胞中IL-8、IP-10和MCP-1的表达，miR-106b和miR-20a共同抑制它们的表达。

食源性沙门氏菌携带质粒介导的喹诺酮类耐药基因的液相芯片检测技术研究

目的:建立应用新型液相芯片技术检测食源性沙门氏菌携带的质粒介导喹诺酮类耐药(PMQR)基因中4种基因:qnrS、aac(6')-Ib-cr、oqxA、oqxB的方法。方法:针对食源性沙门氏菌携带的qnrS、aac(6')-Ib-cr、oqxA、oqxB四种PMQR基因,设计对应引物和微球,采用液相芯片技术对7株标准菌株进行特异性实验;对4株各含1种PMQR基因的食源性沙门氏菌进行重复性和灵敏度实验;然后检测来自食源性风险监测的71株耐喹诺酮类沙门氏菌,和普通PCR进行对比实验。结果:成功建立了液相芯片技术检测食源性沙门氏菌携带的qnrS、aac(6')-Ib-cr、oqxA、oqxB四种PMQR基因的方法,携带qnrS基因的耐药株检出限为5 CFU/mL、携带aac(6')-Ib-cr基因的耐药株检出限为25 CFU/mL、携带oqxA和oqxB基因的耐药株检出限为10 CFU/mL。所有阳性判定结果荧光中位值(MFI)均≥5倍阴性对照组。重复性实验变异系数(CV)均小于5%,特异性实验结果特异性100%,阴性菌株无阳性信号反应。qnrS检出率29.6%(21/71)、aac(6')-Ib-cr 35.2%(25/71)、oqxA 28.2%(20/71)、oqxB 23.9%(17/71),方法比对的结果符合率为100%。结论:实验建立的液相芯片技术检测食源性沙门氏菌质粒介导喹诺酮类耐药基因qnrS、aac(6')-Ib-cr、oqxA、oqxB的方法具有灵敏度高、特异性好、稳定性强、结果准确的特点,可以为食源性沙门氏菌PMQR基因的检测以及耐药性的监控提供技术支撑。

分子鉴别诊断(MDD)技术在呼吸道病原体检测中的应用

目的:以靶序列富集多重PCR(Tem-PCR)和液相芯片(xMAP)检测技术结合,建立常见呼吸道病原体的分子鉴别诊断(MDD)平台,对其可靠性进行评估,并用于临床样品的检测。方法:采集苏州大学附属儿童医院呼吸科住院病例呼吸道灌洗液样品22例和苏州大学附属第一医院呼吸内科门诊病例咽拭子样品20例,使用Tem-PCR技术对样品的核酸进行多重扩增,以液相芯片技术进行高通量的多重检测。结果:对已知样品的检测表明该平台具有高度的特异性和敏感性。对42例临床样品进行检测的结果显示,22例呼吸道灌洗液的阳性检出率为63.6%。呼吸道灌洗液阳性检出率高于门诊病例咽拭子样品的阳性检出率,RNA病原体(以病毒为主)的阳性率高于DNA病原体(以细菌为主)的阳性率。结论:建立了呼吸道病原体的MDD平台,具备了对呼吸道传染性疾病的高通量快速诊断能力。

高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒双重液相基因芯片检测方法的建立

为了实现快速检测猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)并同步鉴别高致病性PRRSV毒株(HPPRRSV),根据PRRSV囊膜蛋白GP2基因保守序列和HP-PRRSV特有的Nsp2基因区保守序列设计特异扩增引物和杂交探针,通过双重一步法RT-PCR不对称扩增和双重微球杂交反应,建立了双重液相基因芯片方法。对12株PRRSV以及其他12种猪病原体的检测显示,该法能特异性检测12株PRRSV毒株并准确鉴别其中7株HP-PRRSV,与其他病原体无交叉反应;对PRRSV、HP-PRRSV病毒液的检测低限均小于每个反应0.5TCID_(50);其组内、组间检测变异系数均<10%;检测55份疑似临床样品并与商品化荧光RTPCR试剂盒比较检测结果,符合率达98.2%(54/55)。研究结果为适应临床快速检测PRRSV提供了一种新的分子生物学检测方法。

液相芯片技术的原理与应用进展

液相芯片是20世纪90年代中期发展起来的被喻为后基因组时代的新型芯片技术,具有高通量、灵活、快速、准确、重复性好、操作简便等众多优点,可用作蛋白质和核酸等生物分子的高通量检测平台。本文简要介绍其原理、优点,并对该技术在基础研究、临床诊断等方面的应用进展作一综述。

转基因小鼠常见传染病血清学液相芯片技术多重检测方法的建立

目的制备小鼠MHV、LCM、ECT和HANT液相芯片,建立转基因小鼠传染病抗体的xMAP多重检测方法。方法将荧光微球分别与小鼠MHV、LCM、ECT和HANT蛋白进行偶联,并且对最佳蛋白偶联量、检测抗体最佳工作浓度和Streptavidin-PE最佳工作浓度进行优化,制备小鼠MHV、LCM、ECT和HANT液相芯片,对56个转基因小鼠血清样品、阴性血清、阳性血清和质控血清进行xMAP多重检测。并应用传统的ELISA方法对xMAP检测结果进行验证。结果 1)小鼠MHV、LCM、ECT和HANT蛋白的最佳偶联量分别为20μg、20μg、40μg和20μg,检测抗体最佳浓度分别为2μg/mL、2μg/mL、2μg/mL和4μg/mL;Streptavidin-PE抗体最佳浓度均为2μg/mL;(2)xMAP检测结果显示,14号、23号、55号和56号转基因小鼠血清MHV MFI值和index值均高于质控血清,其余小鼠血清的MFI值和index值均低于质控血清,表明14号、23号、55号和56号转基因小鼠MHV抗体阳性,其余小鼠MHV、LCM、ECT和HANT抗体阴性;(3)ELISA检测结果显示,14号、23号、55号和56号转基因小鼠MHV A450值和index值均高于质控血清,其余小鼠血清的A450值和index值均低于质控血清,表明14号、23号、55号和56号转基因小鼠MHV抗体阳性,其余小鼠MHV、LCM、ECT和HANT抗体阴性,该ELISA检测结果与xMAP检测结果相一致。结论建立的xMAP多重检测技术可应用于转基因小鼠的传染病检测。

HBV感染后慢性化进展过程中miRNA表达HBV基因型P基因点突变的研究

目的探讨HBV感染引起的肝脏病变慢性化进展为慢性乙肝、肝硬化、肝癌之相关因素，分析各因素在肝脏病变慢性化演变过程中的作用及在诊断、治疗、判断预后中的应用价值。方法采用xMAP液态芯片技术定量检测HBV相关肝痛标本中PBMCmiR-191、-223、-222、-145、-21、-31、-126、-20a、-372的表达水平； 采用直接测序法检测相应血清标本HBV基因型7ZP基因区耐药位点突变；对HBV相关肝病慢性化进展的各可能相关因素包括性别、年龄、HBV基因型、HBVDNA载量水平、HBeAg状态、miRNA表达水平作多因素Logistic回归分析，探讨参与HBV感染引起的肝脏病变慢性化演变过程的相关因素。结果HBVC基因型、DNA载量持续高水平表达、miR-20a表达上调、miR-126及miR-223表达下调是在乙肝慢性化进展中有统计学意义的影响因素（P〈0．05），而HBeAg状态、自然状态下发生的耐药相关位点突变，年龄、性别等因素差异无统计学意义（P〉0．05）。结论C基因型，HBVDNA持续高载量以及miR-126、-223低表达，miR-20a高表达可能是导致乙肝慢性化的相关因素，尤其可能是肝癌发生的危险因子，常规检测基因型、HBV DNA及miRNA的定量检测可为监测病情、判断预后、及时治疗预防乙肝慢性化进展提供资料。

浅谈规划成果数据建库的方法及实现

规划成果数据是城市空间数据的重要组成部分,建立规划成果库是城市规划部门更好开展业务的需要。本文结合东莞市规划成果数据建库的实例,探讨了规划成果数据建库的方法和思路,说明了如何在GIS管理模式下,实现与CAD规划成果数据的有效集成与更新。

恒河猴与食蟹猴血清多重细胞因子检测及分析

目的测定和比较健康恒河猴与食蟹猴基础血清细胞因子水平。方法分别采集15只健康恒河猴和15只健康食蟹猴血清,采用luminex xMap技术测定血清43种细胞因子的浓度,根据正态性检验(W检验)结果选择随机t检验或非参数检验(Mann-Whitney test)比较群体间差异。结果测定的43种细胞因子中,1种促炎症因子(IL-15)、3种抑炎症因子(IL-1RA、IL-6Rα和s CD27)和1种趋化因子(CCL5/RNATES)存在显著性群体间差异。结论研究结果表明,恒河猴与食蟹猴基础血清细胞因子水平差异不显著,用于生物医学研究中具有一定的可比性。同时,本研究结果可为相关研究提供基础数据。

兔免疫球蛋白液相芯片的制备及其检测方法的建立

目的制备实验兔的免疫球蛋白液相芯片，建立液相芯片技术（xMAP）检测方法。方法分别将兔IgG、IgM和IgA亲和纯化的捕获抗体耦联至荧光编码微球，对蛋白耦联量进行优化，制备兔IgG、IgM和IgA液相芯片，同步检测白毛黑眼兔（WHBE兔）和日本大耳白兔（JW兔）血清中IgG、IgM和IgA相对含量，建立可应用于实验兔免疫球蛋白半定量检测的xMAP方法，并对其结果用ELISA方法进行验证。结果（1）IgG、IgM和IgA的最佳蛋白耦联量分别为10、20和15№。（2）xMAP检测结果显示，WHBE兔血清中IgG、IgM蛋白含量显著低于删兔（P〈0．05），IgA蛋白含量显著高于Jw兔（P〈O．01）；ELISA检测结果表明，WHBE兔血清中IgG、IgM蛋白含量显著低于Jw兔（P〈0．05，P〈0．01），其中IgM蛋白含量变化达到极显著水平，IgA蛋白含量显著高于Jw兔（P〈0．01）。结论应用制备的兔IgG、IgM和IgA液相芯片建立的xMAP方法，对实验兔血清进行检测，检测结果与ELISA结果一致，提示该方法可应用于实验兔血清的IgG、IgM和IgA半定量检测。

应用流式液相芯片技术分析厦门地区女性人乳头瘤病毒感染现状

目的利用流式液相芯片技术检测人乳头瘤病毒基因的27个亚型,研究厦门地区女性HPV隐性感染及亚型分布状况,为女性人群宫颈癌健康筛查提供依据,做到早预防、早治疗,进而减低宫颈癌发生的风险。方法利用流式液相芯片技术对本院517例健康体检女性宫颈脱落细胞进行人乳头瘤病毒基因的27个常见亚型的检测。统计分析整体总人群和不同年龄组:总的、HPV低危型的、HPV高危型的和HPV低/高危型混合的感染率;以及HPV亚型分布特点。结果总的HPV感染占受检人群的19.3%,低危感染占5.8%、高危感染占15.5%,各年龄组差异不明显;HPV阳性例数中混合感染例数占27.0%,在31~35、36~40和46~50岁这三个年龄段中混合感染率较大;HPV亚型分布特点:31~50年龄段低危亚型感染呈多样化,而25~30年龄段和>50岁年龄段低危亚型感染较单一;HPV高危亚型25~30年龄组感染以18型和52型为主;31~35年龄组16和52型最多,其次是18和59型;36~40年龄组51、52、53、56和59型较其他型多见;41~45年龄组52型较多见;46~50年龄组39、51、52、58较其他型多见;51~55年龄组亚型分布较简单,仅有51、52和53型,其中以52型最多见;>55年龄组HPV阳性的7人检出的高危亚型有16、39、52、56和58。结论总的HPV感染率、低危型HPV感染和高危型HPV感染各年龄段无明显差异,但高危感染率均高于低危感染率;低/高危型混合感染率人群中有较高比例;本地区女性各年龄段都有宫颈癌常见亚型感染,不同年龄段高发感染的型别略有不同。因此,各年龄段的妇女都应重视HPV筛查,并进行HPV亚型检测,以便更好地评估宫颈癌患病风险,及早预防、监测、治疗。

多种呼吸道病原微生物快速筛查技术的建立

目的解决临床急性呼吸道感染病原微生物快速筛查诊断的难题,建立一种能同时快速检测多种病原体的有效方法。方法采用多重PCR与Luminex xMAP多重分析技术平台相结合,以荧光微球为检测载体,建立快速、多重检测DNA或RNA技术平台。结果经14种(18个亚型)常见呼吸道病原微生物标准株检测,在反应体系中多重PCR产物只与相应的病原菌检测微球杂交,无非特异性反应;通过138例临床标本检测验证,肺炎患者支气管肺泡灌洗液标本中,细菌检出率占总病原微生物的37.68%,其中结核分枝杆菌占18.84%;病毒检出率占总病原微生物的44.93%,支原体、衣原体占17.39%;患者支气管肺泡灌洗液和鼻咽拭子标本中流感病毒A型的检出率分别为18.75%和26.92%。结论多重检测技术平台对急性呼吸道感染疾病的病原微生物快速检测具有实用价值,尤其在解决流行病病原学分析方面具有重要意义。

猪细小病毒和猪圆环病毒2型二重液相芯片检测方法的建立

作者拟建立检测猪细小病毒(PPV)和猪圆环病毒2型(PCV2)的二重液相芯片(xMAP)检测方法,以满足出入境检疫和临床高通量检测的要求。依据GenBank中PPV结构蛋白VP2基因及PCV2全基因序列,设计PPV和PCV2特异性探针、引物及探针互补序列,将探针与磁性微球偶联,对下游引物和探针互补序列标记生物素,采用不对称性二重PCR扩增靶序列,将PCR产物与偶联好的探针进行杂交,用液相芯片仪进行检测。通过对检测条件优化,建立检测PPV、PCV2两种病毒的二重液相芯片技术,并对临床样本进行检测。建立的PPV和PCV2二重液相芯片检测方法,特异性良好,该方法对PPV和PCV2基因拷贝数检测下限分别为1.53×104、2.58×102;对56份临床样品检测表明,该方法与单项PCR检测结果符合率为100%。成功建立了PPV、PCV2二重xMAP检测方法,该检测技术可用于出入境检疫和兽医临床检验。

液相芯片技术同时检测六种猪繁殖障碍病毒的方法研究

在GenBank中收集猪细小病毒（PPV）结构蛋白VP2基因、猪圆环病毒2型（PCV2）的ORF2序列、猪伪狂犬病毒（PRV）的gB基因、猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）的NSP2基因、猪瘟病毒（CSFV）的E2基因和乙型脑炎病毒（JEV）的M基因，利用Primer 5.0等分子生物学软件对收集的序列分析比较，筛选出上述基因的特异保守序列并设计引物和探针，将设计好的探针与相应的微球偶联，优化条件，建立检测方法。结果表明：建立的检测PPV、PCV2、PRV、PRRSV、CSFV、JEV 6种病毒核酸的多重液相芯片技术具有较好的特异性、敏感性和稳定性，对PPV、PCV2、PRV、PRRSV、CSFV、JEV 6种病毒核酸的最低检出量分别为8.50×102 copies/μL、2.87×102 copies/μL、2.07×102 copies/μL、2.61×102 copies/μL、2.34×102 copies/μL、2.05×102 copies/μL，与相应病毒PCR/RT-PCR检测方法相比，敏感性提高了100-1000倍；对临床388份样品同步进行荧光PCR与液相芯片检测，结果99.87%相符。本方法为液相芯片技术在动物多病毒快速高通量检测、鉴别诊断等应用方面奠定了基础。