人着色性干皮病D组基因的克隆及其真核表达

着色性干皮病D组蛋白(Xeroderma pigmentosum group D,XPD)是基础转录因子ⅡH(Transcript factorⅡH,TFⅡH)复合体的第二大亚基,它在转录和核苷酸剪切修复过程中都发挥着重要作用。我们利用人宫颈鳞癌上皮细胞(HeLa细胞)中提取的总RNA进行逆转录酶-聚合酶链反应(Reverse transcriptase-polymerase chain reac-tion,RT-PCR),克隆出人全长XPD cDNA,把此基因按野生型插入表达绿色荧光蛋白的pEGFP-N2质粒,构建了pEGFP-N2/XPD重组体质粒,并将其转染入整合有乙肝病毒X蛋白(Hepatitis B virus X protein,HBx)的人肝癌细胞Hep3B,分析重组细胞的XPD表达水平、HBx表达水平和细胞增殖力,为进一步研究XPD的各种生物学活性及作用机制奠定了基础。

XPD和P53对HepG2.2.15增殖及乙型肝炎病毒X蛋白表达的影响

目的:探讨人着色性干皮病基因D(XPD)和P53对人肝癌细胞株HepG2.2.15增殖及乙型肝炎病毒X蛋白(HBx)、Bcl-2和Bax基因表达的影响。方法:用脂质体转染法将重组质粒pEGFP-N2/XPD和空载质粒pEGFP-N2转染HepG2.2.15细胞,转染后第2天给予20μmol/L的Pifithrin-α(P53抑制剂)孵育24h。分为空白对照组、pEGFP-N2组、pEGFP-N2/XPD组、pEGFP-N2/XPD+Pifithrin-α组及Pifithrin-α组。用RT-PCR和Westernblotting方法检测XPD、HBx、Bcl-2和Bax表达的变化;用MTT法观察细胞增殖活力;用流式细胞仪检测细胞周期。结果:(1)重组质粒pEGFP-N2/XPD的转染使得XPD表达增高(均P<0.001);XPD表达增高使得HBx和Bcl-2表达降低,同时使得Bax表达增高,而Pifithrin-α能抑制XPD这一作用(均P<0.01)。(2)XPD表达增高抑制了细胞增殖活力,而Pifithrin-α能抑制XPD降低细胞活力的作用(均P<0.001)。(3)XPD表达增高引起了细胞G1期增加、S期减少,而Pifithrin-α能抑制XPD这一作用(均P<0.001)。结论:XPD是通过P53途径抑制肝癌细胞增殖,下调HBx和Bcl-2的表达并上调Bax的表达;XPD、P53和HBx三者之间能相互作用、相互影响,共同调节肝癌的发生与发展。

人剪切修复基因XPD肝癌对人HepG2细胞中Rb和MAD2表达的影响

目的:探讨人剪切修复基因着色性干皮病D组基因(xeroderma pigmentosum group D,XPD)转染人肝癌HepG2细胞后视网膜母细胞瘤蛋白(retinoblastoma,Rb)和有丝分裂阻滞缺陷蛋白2(mitotic arrest deficient 2,MAD2)表达的变化及对细胞增殖的影响。方法:将人工合成的pEGFP-N2-XPD重组质粒通过LipofectamineTM2000转染HepG2细胞。实验分为4组,分别为无转染HepG2细胞组(空白对照组)、脂质体转染HepG2细胞组(脂质体组)、空载质粒pEGFP-N2转染细胞组(N2组)和重组质粒pEGFP-N2-XPD转染细胞组(XPD组)。分别用RT-PCR和Western blotting法检测各组细胞中XPD、Rb及MAD2 mRNA和蛋白的表达量,用MTT法检测各组细胞的增殖活力,流式细胞术检测各组的细胞凋亡情况及细胞周期。结果:与其它3组相比,XPD组XPD mRNA及蛋白表达量明显升高(P<0.05),Rb mRNA及蛋白表达量明显升高(P<0.05),而MAD2 mRNA及蛋白表达量显著降低(P<0.05)。XPD组细胞增殖活力显著降低,细胞凋亡率明显升高(P<0.05)。XPD组细胞停滞在G1期,难以进入S期。结论:XPD可以抑制MAD2的表达和肝癌细胞的增殖,促进Rb的表达。

人剪切修复基因XPD对肝癌细胞P53和Ets-1基因的作用

目的探讨人剪切修复基因XPD对肝癌细胞P53和Ets-1基因的影响。方法使用脂质体瞬时转染技术,将pEGFP-N2-XPD重组质粒转染至肝癌细胞HepG2,24 h后加入20μmol/L的P53抑制剂Pifithrin-α,孵育24 h,并以未经转染的HepG2细胞作为空白对照。RT-PCR、Western blot检测细胞中XPD、P53、phosphoP53(ser-15)、Ets-1的mRNA和蛋白的表达变化,MTT法观察细胞增殖的活力,流式细胞仪检测细胞周期变化。结果与空白对照比较,转染pEGFP-N2-XPD重组质粒后,HepG2细胞XPD、P53 mRNA和蛋白表达上调(P<0.01),而Ets-1 mRNA和蛋白表达下调(P<0.01),加入Pifithrin-α后,XPD、P53 mRNA和蛋白表达下调,Ets-1mRNA和蛋白表达上调(P<0.01)。转染pEGFP-N2-XPD重组质粒后,HepG2细胞进入S期发生阻滞,停滞在G1期(P<0.01),加入Pifithrin-α后,HepG2细胞G1期细胞减少,S期细胞增多(P<0.01)。转染pEGFP-N2-XPD重组质粒后,HepG2细胞增殖活力下降(P<0.01),加入Pifithrin-α后,HepG2细胞增殖活力上升(P<0.01)。结论野生型XPD基因在转染至肝癌HepG2细胞后,可以上调P53的表达,通过P53途径抑制Ets-1的表达,促使肝癌细胞凋亡。

人剪切修复基因XPD对人肝癌SMMC-7721细胞中Ets-1和Cdk6基因的调控作用

目的:观察野生型人剪切修复基因XPD转染入人肝癌细胞SMMC-7721后,细胞内Ets-1和Cdk6基因的表达变化及对SMMC-7721肝癌细胞增殖的影响。方法:将人工合成的pEGFP-N2-XPD重组质粒通过Lipofectamine 2000TM转染SMMC-7721细胞。设重组质粒转染细胞SMMC-7721-pEGFP-N2-XPD(XPD)组、空载质粒转染细胞SMMC-7721-pEGFP-N2(N2)组、脂质体组、无转染空白对照组。分别用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)和蛋白印迹法(Western blot)检测细胞中XPD、Ets-1、Cdk6基因mRNA和蛋白质的表达量,并用流式细胞仪检测细胞周期变化,四甲基偶氮唑盐微量酶反应比色法(MTT)检测各组细胞的增殖活力。结果:XPD组中的XPD的mRNA和蛋白质表达较其他3组明显增高(P<0.001),而Ets-1、Cdk6 mRNA和蛋白质表达较其他3组明显减少(P<0.001)。转染pEGFP-N2-XPD重组质粒后细胞停滞在G1期,难于进入S期。转染了野生型XPD的SMMC-7721细胞增殖能力减弱。结论:XPD基因可能通过抑制Ets-1、Cdk6基因的表达影响肝癌细胞的生长。

年龄相关性白内障患者晶状体上皮细胞的DNA修复酶XPD和XRCC1基因组型的表达及其羟自由基水平的变化

目的探讨年龄相关性白内障患者与未患该病的一般人血细胞以及培养的晶状体上皮SRAOI／04细胞的DNA修复酶XPD-751、XRCC1—399以及羟自由基水平的差异。方法实验研究。2008年3月至2009年10月，自郑州人民医院30例白内障患者手术切除之晶状体上皮细胞和30例同龄未患该病的一般人的血细胞以及培养的SRAOI／04细胞分别提取基因组DNA进行实验研究，应用PCR．限制性内切酶长度多态性技术检测其DNA修复酶XPD-751／XRCC1—399的多态性，并以SRA01／04细胞和白内障患者的周血细胞分别作为对照，同时进行羟自由基检测。所得数据组间比较应用单因素方差分析。结果未患白内障的一般人及SRAOI／04细胞均呈现XRCCl-Gln399Gln和XPD—Lys751Lys。白内障患者晶状体上皮细胞及其周血细胞皆呈现XPD—Lys751Gin多态性和XRCC1-Gln399G1n型，后者与前者之间均未见差异。白内障患者晶状体上皮细胞和外周血细胞的羟自由基分别为（0．204±0．7）和（0．188±0．07），高于未患白内障的一般人（t=211．20，P〈0．05）。结论年龄相关性白内障患者晶状体上皮细胞DNA修复酶呈现XDP—Lys751Gln多态性且羟自由基水平较高，可能与晶状体白内障的罹病风险有关。

联合分析XRCC1、XPD和GSTP1基因单核苷酸多态性在铂类药物化疗敏感性中的预测作用

目的 联合分析X线修复交叉互补基因1（X-rayCOrSS—complementing1，XRCCl）第194和399位点，着色性干皮病基因D（XerodermapigmentosumgroupD，XPD）第312位点及谷胱甘肽-s-转移酶P1基因（GlutathioneS-Transferasepl，GSTPl）第105位点的单核苷酸多态性（singlenucleotidepolymorphisms，SNPs）在预测铂类药物化疗敏感性中的作用。方法采用基因测序法对50例恶性肿瘤患者的外周血进行XRCCl、XPD和GSTPl基因单核苷酸多态性（SNPs）检测，分析各基因型与铂类药物化疗敏感性的关系。结果有效率高的基因型为：XRCC1194位点的Arg／Trp和Trp／Trp，XRCC1399位点的Arg／Arg，XPD312位点的Asn／Asn，GSTPl105位点的Val／Val，它们的化疗有效率分别为57．1％、75．0％、60．9％、85．7％、87．5％。有两个以上和有1个或0个高效基因型患者的化疗有效率分别是78．9％、36．4％和0，有两个以上高效基因型的患者的敏感性明显高于有1个或0个高效基因型的患者，其差异有统计学意义（x2=25．79，P〈0．01）。结论对XRCC1、XPD和GSTP1基因的单核苷酸多态性进行联合检测，可能预测患者对铂类药物的敏感性。

人类8-羟基鸟嘌呤DNA糖苷酶1及着色性干皮病基因D基因多态性与胃癌遗传易感性的关系研究

目的 探讨人类8-羟基鸟嘌呤DNA糖苷酶1（hOGG 1）基因和人类着色性干皮病基因D（XPD）基因多态性与胃癌遗传易感性的关系.方法 收集胜利石油管理局胜利医院98例胃癌患者和80例非肿瘤对照组志愿者,内镜窄带成像（NBI）模式下取出病理组织,应用聚合酶链反应-限制性片段长度多态性（PCR-RFLP）检测法检测胃癌人群的外周血中DNA损伤修复酶基因多态性,分析其与肿瘤遗传易感性的关系.结果 Lys751 Gln基因型使胃癌的发病风险增加1.5倍（OR值=1.486,0.730 ～3.025）.两基因的交互作用使胃癌的发病风险降低（S＜1,API =0.24）.结论 Lys751 Gln基因型与个体患胃癌疾病的易感性可能有相关性.

XPD Asp312Asn单核酸多态性与奥沙利铂为基础方案化疗疗效的关联研究

目的探讨XPD Asp312Asn单核酸多态性在预测以奥沙利铂为基础方案的转移结直肠癌患者化疗疗效的价值。方法应用Taq Man荧光探针Real-Time PCR分析方法对106例接受奥沙利铂为基础方案(FOLFOX4方案72例,XELOX方案34例)化疗的转移结直肠癌患者进行着色性干皮病互补基团D(XPD) Asp312Asn基因型测定。Logistic回归分析疗效,Kaplan-Meier方法预测生存期。结果 106例结直肠癌患者化疗有效率为57. 6%(61/106),两种化疗方案中G/G、G/A和A/A基因型在化疗有效组和无效组之间分布的差异无统计学意义(P> 0. 05)。多因素生存分析显示A/A基因型、癌胚抗原(CEA)≥5 ng/ml和年龄≥65岁的患者生存时间相对较短,具有统计学意义(P <0. 05)。结论 XPD Asp312Asn单核酸多态性可以作为转移结直肠癌患者生存期的一个预测指标,但与奥沙利铂药物敏感性的关联不大,需要进一步论证。

CYP2C19、ERCC2、XRCC1的不同基因型与新疆地区胃食管反流及食管裂孔疝疾病临床指标的关系

目的 探讨CYP2C19、ERCC2、XRCC1的不同基因型与新疆地区胃食管反流(GERD)及食管裂孔疝疾病临床指标的相关性。方法 前瞻性研究2016年1月至2017年12月,新疆维吾尔自治区人民医院临床确诊为胃食管反流及食管裂孔疝的101例患者的临床资料,并用Wilcoxon秩和检验方法对其所测基因型与相关临床指标进行统计分析。结果 CYP2C19含A/A纯合基因型与含其他两种基因型(G/A或G/G)患者的食管裂孔疝距离比较差异有统计学意义(P <0. 05),含G/G纯合型与含A/G杂合型患者的食团内部压力(IBP)比较差异有统计学意义(P <0. 05);ERCC2含A/C杂合型和A/A纯合型的患者的食管下括约肌(LES)残余压、LES松弛率、无效吞咽百分比比较差异有统计学意义(P <0. 05),该基因型中含有C越多的患者,IBP(平均最大值)越低,并且这种规律具有统计学意义(P <0. 05);XRCC1不同基因型间的所有临床指标差异均无统计学意义。结论 CYP2C19、ERCC2不同基因型与胃食管反流及食管裂孔疝疾病临床指标密切相关。CYP2C19含A/G或G/G基因型与GERD和食管裂孔疝的发病有相关性,CYP2C19含A/G和G/G基因型人群可能为食管裂孔疝的高发人群,G/G纯合基因型可能是加重反流性食管炎的高危因素;ERCC2含A/C、C/C基因型与食管裂孔疝的患病有相关性,ERCC2基因型中含C碱基越多对于减小IBP的作用越大,说明ERCC2基因型中含C碱基越多与食管裂孔疝的患病率可能呈负相关。