XynⅢ包涵体的纯化与变复性研究

常规诱导表达后收集的粗包涵体经 3mol/L尿素洗涤加上表面活性剂TritonX -10 0作用 ,可将包涵体中xynⅢ的含量从 3 7%提高到 92 .4% ;8mol/L尿素可将包涵体完全溶解 ;蛋白浓度在 0 .2～ 0 .2 5mg/mL时 ,pH4.5 5 0mmol/LNaOAc与pH 7.5 2 0mmol/LTris HCl缓冲液复性效果相当 ;降低蛋白浓度 ,则是pH 7.5 2 0mmol/LTris HCl缓冲液复性效果相对较好 ;复性过程中加入DTT、EDTA、尿素、木糖等处理复性效果没有明显提高 ;pH7.5 2 0mmol/LTris HCl、0 .0 1mg/mL蛋白浓度条件下 。

分子对接阐明草甘膦与水稻醛酮还原酶(OsALR2)的作用及OsALR2的表达纯化

草甘膦是一种广谱高效的有机磷类除草剂,因其对水稻等禾本科作物缺乏选择性,导致其在水稻田中的应用受到限制。杂草中醛酮还原酶(aldo-keto reductase,AKR)具有降解小分子农药草甘膦的功能,但是水稻响应草甘膦的作用机制未知。本文通过生物信息学分析、分子对接研究草甘膦与其在水稻中的靶标AKR蛋白OsALR2的互作机制。采用TMHMM 2.0和DiANNA 1.1 web server等在线软件对OsALR2蛋白的跨膜特性和二硫键含量等生物学特性进行了分析,结果表明OsALR2分子量为35 kD,等电点为5.89;OsALR2不是膜蛋白,但是含有3组二硫键。使用AlphaFold预测OsALR2蛋白的三级结构,并利用Auto Dock Vina将草甘膦与OsALR2进行分子对接,结果显示,最低结合能为-13.4 kcal/mol,草甘膦与OsALR2的结合主要通过氢键作用。通过Ramachandran图,ERRAT和Verify 3D证明对接获得的三维结构是合理的。进一步通过分子克隆技术构建重组表达载体pET-32a-OsALR2并进行原核表达,结果显示OsALR2主要以包涵体的形式表达,对包涵体进行变复性后,蛋白表现出酶活性且蛋白结构有较好的均一性。本文的研究结果助于阐明草甘膦与水稻蛋白互作的分子机制,为研发抗草甘膦水稻新品种和新型小分子农药提供理论指导。

包涵体蛋白的复性研究进展

介绍了包涵体的洗涤、变性溶解和传统的复性方法,详细阐述了包涵体蛋白的层析复性方法以及复性过程中的添加剂效果。

变性再复性方法提取高纯度Cav1.2片段GST-CT1及其生物活性的鉴定

目的探寻诱导谷胱甘肽转移酶(GST)与Cav1.2钙通道片段CT1重组的易形成包涵体的大分子融合蛋白的提取与纯化的方法。方法在E.coli BL21中转化入p GEX-6p-3/CT1重组质粒并诱导表达,采用GST包涵体变性复性试剂盒和非离子去污剂B-PER分离纯化GST-CT1融合蛋白,用Pull down assay方法鉴定GST-CT1融合蛋白及其生物活性。结果应用GST包涵体变性复性试剂盒和非离子去污剂B-PER能够分离得到高纯度的易形成包涵体的GST-CT1融合蛋白,且分离纯化的GST-CT1融合蛋白具有与钙调蛋白结合的生物活性。结论操作简易的GST包涵体变性复性法能够针对易形成包涵体的GST-CT1融合蛋白进行分离和纯化,且得到的蛋白具有生物学活性。

Hofmeister效应与包含体的变性和复性

Hofmeister效应反映了溶质小分子通过与水分子的相互作用 ,对蛋白质等生物大分子造成的结构上的影响。通过对此效应的深入研究 ,可以从理论上解释许多常见的生理生化现象。蛋白质的变性、复性问题是与Hofmeister效应密切相关的生化基础课题。

HBV/HEV融合抗原大肠杆菌表达包涵体的变复性和纯化

利用乙型肝炎病毒adr型的S抗原基因和戊型肝炎病毒China-D型的ORF2编码区的羧基末端中的部分序列构建融合抗原表达载体,在大肠杆菌中表达时,出现了大量包涵体,我们对包涵体进行洗涤,变性,复性,金属亲和层析柱和凝胶过滤纯化后,蛋白的相对含量达98%。采用Western blot对目的蛋白活性进行检测,具有乙肝和戊型肝抗原活性。为提高资源利用效率,降低成本,提高产量,以及进一步研发疫苗用抗原提供了实验基础。

大肠杆菌中重组猪生长激素提取方法及变复性的比较研究

通过对基因工程菌pgh/E.coliBL 21用酶溶解、超声波处理、超声波处理与液氮冻融相结合三种方法进行破菌,用盐酸胍法进行变复性,提取重组猪生长激素(rpGH).结果表明用超声波处理与液氮冻融相结合的方法裂解细菌,盐酸胍法变复性,rpGH的提取率最高,达72.16％;而用尿素法对rpGH在大肠杆菌内所形成的包涵体变复性,rpGH的提取率仅为49.82％.

大肠杆菌异源重组蛋白质的变性与复性

描述了大肠杆菌异源重组蛋白质的形成、制备、变性和复性,综述了国内外变性、复性的有效方法。

重组人血管抑素(rhAGN)包涵体变性与复性初探

在优化的培养条件下,进行rhAGN5L罐发酵,菌体干重由原摇瓶发酵的3.02g/L增加到8.06g/L,表达量依然稳定在35%;对所产生的包涵体进行溶解变性研究,确定较佳变性缓冲液组成为8mol/L尿素,50mmol/LTrisHCl,20mmol/LDTT,pH值8.0;凝胶过滤色谱复性效果相对较好,蛋白浓度4.28μg/ml(IC50)时对HEMC细胞的抑制活性达50.1%。

由大肠杆菌中提取重组猪生长激素的研究

本文通过研究提出了一种由大肠杆菌细胞中提取重组猪生长激素的方法。提取回收率为52.4％,纯度为94.1％,具有生物学活性。

重组融合蛋白TGFα－PE40的分离纯化和热稳定性研究

报告了重组融合蛋白ＴＧＦα－ＰＥ４０的分离纯化方法及稳定性研究。采用对原生质体进行超声破碎，抽得纯度为８０％的包涵体。包涵体用８Ｍ尿素变性后，再对ｐＨ９．０的缓冲液进行透析复性，最后经过ＭｏｎｏＱ柱及Ｓｕｐｅｒｄｅｘ－７５柱进行分离，可得到纯度为９８％的高活性ＴＧＦα－ＰＥ４０。经稳定性测试，纯化的ＴＧＦα－ＰＥ４０在４℃中可存放半年以上，并在５０℃以下活力稳定。

多功能过氧化物酶介导Mn(Ⅲ)络合体系对酚类化合物的氧化降解

【背景】酚类化合物是环境中主要的水体污染物之一。多功能过氧化物酶(versatile peroxidase,VP)介导的Mn(Ⅲ)-有机酸络合体系具有较高的氧化还原电势,在酚类有机污染物降解方面具有巨大潜力。【目的】探究VP介导的Mn(Ⅲ)-有机酸络合体系降解酚类化合物的能力,为酚类化合物的降解提供新的思路和方法。【方法】研究选取了糙皮侧耳(Pleurotus eryngii)来源的多功能过氧化物酶(PeVP),采用包涵体复性的方法获得了PeVP活性蛋白,并对重组PeVP进行酶学性质研究及Mn(Ⅲ)络合体系反应条件优化,进而探究Mn(Ⅲ)络合体系对酚类污染物的氧化降解能力。【结果】确定了PeVP包涵体复性最佳条件为:pH 9.5、10%甘油、0.5 mol/L尿素、0.5 mmol/L氧化型谷胱甘肽(glutathione oxidized,GSSG)、0.1 mmol/L二硫苏糖醇(dithiothreitol,DTT)、0.1 mmol/L乙二胺四乙酸(ethylenediamine tetraacetic acid,EDTA)、5 mmol/L CaCl_(2)、5μmol/L羟高铁血红素(hematin),4℃静置透析24 h,最后5μmol/L hematin孵育12 h。通过对PeVP介导的Mn(Ⅲ)-有机酸络合体系优化,确定了最优反应条件为:75 mmol/L苹果酸缓冲液(pH 4.5)、6 mmol/L Mn^(2+)和0.2 mmol/L H_(2)O_(2)。在上述条件下,探究了络合体系对2,2-丁香醛连氮-双-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸[2,2ʹ-azinobis-(3-ethylbenzthiazoline-6-sulphonate),ABTS]、2,6-二甲氧基苯酚(2,6-dimethoxyphenol,DMP)、愈创木酚和丁香醛连氮4种酚类模式底物的催化活性,发现在pH 4.5条件下,络合体系对酚类模式底物的氧化活性可达到PeVP直接氧化活性的1.5−7.5倍,并且在16 h的酶解过程中,苯酚、对苯二酚、间苯二酚和对硝基苯酚的平均降解速率分别为10.91、10.69、6.50和5.71 mg/(L·h),推测Mn(Ⅲ)-有机酸络合物对酚类底物的氧化降解是通过夺取酚类底物的电子形成酚类自由基中间体,自由基中间体经过电子重排和C−C键的断裂,最终导致酚类物质的氧化降解。【结论】在弱酸(pH 4.5)条件下PeVP介导的Mn(Ⅲ)-苹果酸络合体系对酚类污染物具备较强的氧化能力,这为酚类有机污染物提供了新的生物解决方案。

牛呼吸道合胞体病毒(BRSV)核蛋白基因原核表达载体的构建及其重组蛋白的纯化与鉴定

利用RT-PCR方法扩增出牛呼吸道合胞体病毒(BRV)核蛋白基因(N)中1 176bp的特异性片段,将目的片段定向克隆到pET-32a(+)原核表达载体,转化BL21(DE3)表达菌;经IPTG进行诱导,并探讨IPTG浓度、诱导时间对重组蛋白的影响。表达的大肠杆菌超声破碎后,沉淀物用含有1%TritonX-100的PBS溶液洗去膜碎片和膜蛋白。在尿素变性条件下,用镍柱亲和层析法纯化NP包涵体,并通过梯度透析方法进行透析复性,Western blot检测目的蛋白的反应原性。结果显示,酶切和测序成功构建阳性重组质粒,将重组质粒转化至大肠杆菌BL21(DE3)经IPTG诱导后发现该重组蛋白主要以包涵体形式存在于细菌中,大小约为60 000,最佳诱导条件为0.000 8 mol/L IPTG诱导4h。通过BCA法测定镍柱纯化的N蛋白质量浓度为0.534g/L,复性后质量浓度为0.397g/L。Western blot检测表明N蛋白具有反应原性。结果表明,在大肠杆菌中成功表达并纯化出N蛋白,并通过复性获得具有反应原性的N蛋白,为N蛋白下一步的应用奠定基础。

原核表达HPV16 L1蛋白的变性、纯化及复性效果评价

目的探讨原核表达HPV16L1蛋白的变性、纯化及复性条件,并对复性效果进行评价。方法将重组质粒pET28a-L1转化E.coliBL21(DE3),经放大培养诱导表达后,收集菌体,超声破碎后提取包涵体,并对其进行洗涤、变性,离子交换层析纯化,然后稀释复性。经电镜观察、红细胞凝集试验以及免疫原性分析,对复性效果进行评价。结果L1蛋白在8mol/L尿素中溶解不完全,SDS、硫脲和高pH值可提高其溶解度;纯化后的L1蛋白纯度可达90%;电镜可观察到VLP,并能凝集小鼠红细胞。免疫家兔后,可产生高滴度的抗体。结论复性的HPV16L1蛋白在体外可自我折叠形成具有正确空间构象的VLP,且具有较好的免疫原性,为进一步研制HPV16预防性疫苗及诊断试剂盒奠定了基础。

新型重组IL-6D24-PE40KDEL外毒素融合蛋白复性及纯化

目的 :对高效表达的重组IL 6D2 4 PE4 0KDEL外毒素融合蛋白进行包涵体的分离、变性与复性以及纯化。方法 :对表达菌体进行超声破碎、洗涤、氧化还原法变性及复性 ,经离子交换层析。结果 :工程菌HB10 1/ pE0 1T的表达产物是以包涵体形式存在 ,菌体的破碎以高渗蔗糖溶液进行预处理后 ,再超声破碎效果最好 ;包涵体的洗涤则先用Triton X 10 0洗 2次 ,再用 8mol/L尿素洗涤一次效果更优 ;最佳变性条件为在 7mol/L盐酸胍中加入0 .0 6 5mmol/L的DTT和 0 .2mol/L的盐酸精氨酸 ;最佳复性条件为在 10℃复性保持 2 4h ,蛋白浓度保持在 30～80 μg/ml,并需加入 0 .2mol/L盐酸精氨酸 ;利用谷胱甘肽的氧化还原法 ,当氧化型谷胱甘肽与还原型谷胱甘肽的浓度比在 2∶1时所获得的活性成分得率最高 ;利用强弱离子交换结合的方法能获得纯度为 95 %的目的蛋白 ,所得融合蛋白可与IL 6及PEA抗体相结合并能特异性地杀伤高表达IL 6R的人多发性骨髓瘤细胞。结论 :本研究获得重组IL 6D2 4 PE4 0KDEL外毒素融合蛋白包涵体的分离、变性与复性条件和一条能获得大量高纯度该融合蛋白的纯化路线。

蛋白质复性技术研究进展

在实验室和工业领域中,快速而廉价地制备目的蛋白的方法对于促进蛋白质科学和工程的研究至关重要。使用基于包涵体的蛋白质表达系统是一种经典的方法,在上游过程中可以获得高产量,但是在下游过程中未正确折叠的蛋白质复性过程通常会导致产量显著降低。最具挑战性的是,蛋白质的复性条件因构象不同各有差异,需要个体化的针对性研究进行反复试验来提高蛋白质终产量。因此,为了将这种麻烦的折叠过程转变为常规的折叠过程,基于新技术和新材料的各种方法应运而生。文章首先简略地概述蛋白质折叠,总结包涵体变性的不同方式,重点对在复性过程中的三种思路进行了综述,并就蛋白质复性方面已报道的热点描述了方法发展背后的概念,以期提供一种通用的复性研究思路。

正交试验设计筛选scFv包涵体变性和复性工艺

单链抗体(single-chain variable fragment,scFv)包涵体的变性和复性受p H值、温度、盐浓度、氧化还原电对、添加剂等多种因素影响,快速找到合适的变、复性条件是蛋白质纯化的重点和难点。本试验以scFv-Z2为研究对象,通过正交试验设计筛选scFv-Z2包涵体的变性和复性条件,找出关键的影响因素,得到最适变性条件:6 mol/L盐酸胍变性,变性时间24 h;最适复性条件:以4 mol/L尿素、1 mol/L精氨酸(Arg)、1 mmol/L还原型谷胱甘肽(GSH)和0.02 mmol/L氧化型谷胱甘肽(GSGG)的溶液为复性液,样品与复性液比例为1∶30,复性时间7 d。通过SP阳离子柱分离后得到高纯度(99.2%)scFv-Z2单体,经工艺放大重复验证,最终开发出稳定可靠的纯化工艺路线。本研究建立了正交试验设计在scFv-Z2包涵体纯化工艺开发中的新应用。