牦牛乳酪蛋白琥珀酸铁的制备及其结构表征

为了充分利用牦牛乳资源,以牦牛乳酪蛋白为原料,采用响应面分析法确定牦牛乳酪蛋白的最佳酰化条件,制备高质量、生物利用率好的蛋白琥珀酸铁制品;采用傅里叶红外光谱、粒径分布、扫描电子显微镜、氨基酸组成、体外模拟消化等手段对制品进行结构表征。结果表明:牦牛乳酪蛋白最佳酰化工艺参数为:酪蛋白与丁二酸酐质量比2∶1,丁二酸酐分5次加入,pH 9,反应温度48℃,反应时间50 min,在此条件下酰化率达到93.27%,含铁量8%,螯合率93.03%。傅里叶红外光谱测定结果显示:蛋白琥珀酸铁与酪蛋白的吸收峰存在差异,酰化蛋白中铁离子与羧基、氨基形成配位键。用激光粒度分布仪测得蛋白琥珀酸铁粒径更大,证实形成螯合物。扫描电子显微镜分析表明样品表面光滑,结构紧密。通过测定蛋白琥珀酸铁的蛋白含量及氨基酸组成,得出蛋白琥珀酸铁较酪蛋白蛋白质损失28.12%。酪蛋白与蛋白琥珀酸铁中Glu、Asp和Pro含量较高,其中Glu和Asp是形成螯合物的关键氨基酸,且生物利用率优于无机盐。本研究结果可为蛋白琥珀酸铁制备以及结构表征提供参考。

牦牛乳酪蛋白磷酸肽纯化工艺优化及其促钙吸收作用

为了探究牦牛乳酪蛋白磷酸肽(Casein Phosphopeptide,CPP)产品性质和持钙能力,该试验以牦牛乳酪蛋白为原料,采用胰蛋白酶酶解,静态吸附试验确定洗脱剂,同时分析上样量、上样流速、洗脱液浓度对CPP纯化工艺的影响;测定纯化后CPP的基本成分、功能性质、体外抑制磷酸钙和亚铁离子沉淀能力;建立低钙小鼠模型,以体质量、脏器指数、血清生化、股骨指数、骨密度和骨钙为指标,探究CPP在小鼠体内促钙吸收能力。结果表明:以0.2 mol/L稀盐酸为洗脱液,上样流速3 mL/min,上样量100 mL条件下获得的CPP纯化效果最优,其氮磷摩尔比为6.8,磷回收率为95.5%,谷氨酸含量18.55%,丝氨酸含量6.01%;体外促钙实验表明纯化后CPP能有效阻止磷酸钙、亚铁离子沉淀;动物实验结果表明:经28 d喂养,所有小鼠内脏指数均在合理范围内,纯化后CPP无慢性毒性,中高剂量组血钙、血磷含量显著高于模型组(P<0.05),碱性磷酸酶(Alkaline Phosphatase,ALP)值极显著低于模型组(P<0.01),高剂量组股骨指数显著高于碳酸钙组(P<0.05),CPP中、高剂量组骨钙、骨密度显著高于模型组(P<0.05)。综上,该实验可为牦牛乳功能性食品开发提供理论依据,为后续牦牛乳生物活性肽的相关研究提供参考。

中甸牦牛乳酪蛋白源生物活性肽的鉴定及抗氧化活性

以中甸牦牛乳酪蛋白为研究对象,将其进行酶解超滤后,分别对分子质量>3 kDa和<3 kDa酶解组分的促细胞增殖活性和抗氧化活性进行测定,并采用液相色谱-串联质谱、生物信息学及分子对接分析中甸牦牛乳酪蛋白源的生物活性肽。结果表明:酪蛋白酶解超滤后,分子质量>3 kDa和<3 kDa酶解组分均能保证RAW264.7细胞的增殖率在80%以上,2种酶解液均具有1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl,DPPH)自由基和2,2′-联氮-双-(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)(2,2′-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid),ABTS)阳离子自由基清除能力,分子质量<3 kDa酶解组分的促细胞增殖、DPPH自由基、ABTS阳离子自由基清除能力优于>3 kDa酶解组分;基于液相色谱-串联质谱技术从中甸牦牛酪蛋白分子质量<3 kDa的酶解组分中共鉴定到895条肽段,其中96条肽段为已知活性的肽段,主要为抗氧化肽(39.6%)、血管紧张素转化酶抑制肽(30.2%)等,说明中甸牦牛乳酪蛋白是生物活性肽的重要来源;基于肽段的活性和疏水性从预测的20条潜在抗氧化肽中筛选到抗氧化肽GYF、RPW,通过分子对接发现GYF、RPW与ABTS阳离子自由基、DPPH自由基的结合能均为负数,具备结合潜力,且主要通过形成氢键和疏水相互作用发挥抗氧化活性。

牦牛奶中不同酪蛋白的提取及其功能特性分析

本研究利用SDS-PAGE电泳法,对提取的酪蛋白进行纯度分析,测定了不同酪蛋白组分在不同pH下的溶解性、乳化性和发泡性。结果显示,不同的pH会对酪蛋白组分的功能特性产生显著影响。因此,本研究结果可以为牦牛奶产品的加工与开发提供重要参考。

牦牛乳酪蛋白抗氧化肽对HEK293细胞氧化应激损伤的保护作用

本实验采用H_(2)O_(2)诱导HEK293细胞建立细胞氧化损伤模型,确定H_(2)O_(2)最佳处理浓度和时间,研究5条牦牛乳酪蛋白抗氧化肽(AFK、IEQI、FPFF、LPVPQ、RELEEL)对H_(2)O_(2)诱导损伤HEK293细胞存活率、丙二醛含量、抗氧化酶类活力、还原型谷胱甘肽和氧化型谷胱甘肽含量的影响,并探讨牦牛乳酪蛋白抗氧化肽的体外抗氧化作用机制,为其在高附加值生物制品及功能食品领域的开发与应用提供理论依据。结果表明:牦牛乳酪蛋白抗氧化肽对不同的自由基具有不同的清除作用,但均呈剂量效应关系;使用终浓度为400μmol/L的H_(2)O_(2)处理HEK293细胞12 h后,对细胞的抑制率为(46.21±0.40)%;细胞毒性实验分析结果表明,5条抗氧化肽对HEK293细胞既无毒副作用,也无促进增殖作用;牦牛乳酪蛋白抗氧化肽能够显著降低HEK-293氧化损伤细胞中的丙二醛(除LPVPQ)、氧化型谷胱甘肽含量,并增强抗氧化酶活性,其中200μg/mL抗氧化肽RELEEL能够显著降低丙二醛含量至(0.062±0.000)nmol/10^(4) cells,提升谷胱甘肽含量至(61.17±2.48)μg/10^(6) cells,并维持较高的谷胱甘肽/氧化型谷胱甘肽值(64.93±0.95);200μg/mL抗氧化肽LPVPQ能够显著降低氧化型谷胱甘肽含量至(0.74±0.26)μg/10^(6) cells,增强超氧化物歧化酶活力至(1.17±0.02)U/10^(4) cells;200μg/mL抗氧化肽AFK能够显著增强过氧化氢酶活力至(0.60±0.09)U/10^(4) cells。上述结果显示,牦牛乳酪蛋白抗氧化肽对氧化损伤的细胞具有积极影响,可为下一步相关产品的开发提供参考。

冻融处理对牦牛乳酪蛋白胶束组成和稳定性的影响

冷冻贮藏是克服牦牛乳生产的季节性、产量低、泌乳期短等问题的重要手段,本研究探究了冻融处理条件对牦牛乳酪蛋白胶束组成和胶体稳定性的影响。将脱脂后的牦牛和荷斯坦牛原料乳于-18℃和-80℃冷冻贮藏210 d后,分别在4℃、25℃和50℃条件下解冻,通过超高速离心法(135000 g,2 h,25℃)分离牦牛乳中的胶束相和乳清相。监测胶态钙和磷酸根、4种酪蛋白在两相中的分布;通过动态光散射检测酪蛋白胶束直径和直径分布,通过Turbiscan法测试样品经过冻融前后的物理稳定性变化规律。冻融处理促进了牦牛乳溶解相中的钙离子、磷酸根离子、αs1-酪蛋白、αs2-酪蛋白和β-酪蛋白迁移到胶束相中,导致胶束直径和直径多不分散指数增加,物理稳定性降低。冻藏温度相同的条件下,解冻温度越高,胶束相中钙和磷酸根、αs1-酪蛋白、αs2-酪蛋白和β-酪蛋白的含量越大,导致胶束的稳定性越低。在解冻温度相同的条件下,-18℃和-80℃冷冻贮藏条件产生的2种牦牛乳酪蛋白胶束的性质无显著差异。冻融处理对牦牛乳酪蛋白胶束的组成和稳定性有不利影响,低温解冻对牦牛乳酪蛋白胶束组成和稳定性的影响最小。

乳蛋白高效液相色谱检测方法的优化及甘南牦牛乳指纹图谱的建立

建立多种乳蛋白同时检测的高效液相色谱法,为乳及乳制品乳蛋白的分离检测提供方法,并建立甘南牦牛乳的指纹图谱。样品采用缓冲液使蛋白溶解变性,采用高效液相色谱检测,ZORBAX 300SB-C8色谱柱,检测波长为214 nm,柱温40℃,流速0.6 mL/min,梯度洗脱。所建方法能够分离乳中的κ-酪蛋白、α-酪蛋白、β-酪蛋白、α-乳白蛋白、β-乳清蛋白,峰保留时间RSD<1.3%,峰面积RSD<3.3%。10批甘南牦牛乳样品得到的指纹图谱相似度大于0.99,指认了其中9个乳蛋白色谱峰。该方法操作简便、具有良好的重现性和专属性,适用于乳及乳制品中多种乳蛋白的分离检测。所建立的甘南牦牛乳指纹图谱为牦牛乳的质量控制提供参考依据。

琥珀酰化修饰改善牦牛乳酪蛋白胶束结构及疏水性

琥珀酰化是改善食品蛋白质功能性质的常用手段,牦牛乳是青藏高原特色乳资源。为了揭示琥珀酰化对牦牛乳酪蛋白胶束结构的修饰作用,以牦牛乳酪蛋白为原料,研究了琥珀酰化修饰对其结构及疏水性的影响。分别通过傅里叶变换红外光谱分析了修饰前后酪蛋白胶束二级结构变化,采用动态光散射技术分析了修饰前后酪蛋白胶束粒径变化,采用扫描电镜技术观察了酰化反应对酪蛋白的表面形貌的影响。结果显示,牦牛乳酪蛋白胶束二级结构为33.1%β-转角、23.2%无规卷曲,32.0%β-折叠和11.7%大环结构,α-螺旋结构未检出。琥珀酰化修饰后,α-螺旋结构形成,含量为12.4%,其他二级结构含量变化不大。琥珀酰化修饰使酪蛋白胶束粒径减小,由不规则的球形转变为规则的球形,疏水性显著降低。研究结果可为牦牛乳酪蛋白的改性提供参考依据。

牦牛“曲拉”乳酸干酪素生产工艺研究

采用乳酸凝结剂、护色、离心分离等方法,通过正交试验筛选出活性炭最佳使用参数(质量分数2.0%,吸附温度50℃,吸附时间30min),复合护色剂配合比例mNa2S2O4︰mNa2SO3︰mNaHSO3=1.0︰2.0︰2.5),以及离心工艺参数(转速8000r/min,时间10min,温度50℃);确定了牦牛“曲拉”乳酸干酪素生产工艺;制品在感官、理化、微生物等方面符合QB/T3780-1999要求。

高效液相色谱法分离测定牦牛乳中的8种蛋白质

建立了同时分离和测定牦牛乳中4种酪蛋白和4种乳清蛋白的反相高效液相色谱方法。脱脂牦牛乳经分散剂处理后,采用C4色谱柱(250 mm×4.6 mm,300,5μm i.d.)进行分离,以0.1%的三氟乙酸水溶液和0.1%的三氟乙酸乙腈溶液为流动相,流速为0.8 mL/min,梯度洗脱,二极管阵列检测器(DAD)在220nm波长下检测,外标法定量。结果表明,牦牛乳中8种主要蛋白质在40 min内完全分离,在各自的线性范围内呈良好线性,除α-乳白蛋白外,其余7种蛋白的相关系数均大于0.99。8种蛋白质的回收率为86%～103%,相对标准偏差(RSDs)为1.7%～8.7%;检出限(LODs)为10.7～39.2 mg/L,定量下限(LOQs)为35.7～130.7 mg/L。该方法的准确度和精密度均较高,能够满足实际检测的要求。

热处理和酸诱导对鲜牦牛乳酪蛋白功能性质的影响

研究了酸处理和热处理对鲜牦牛乳酪蛋白功能性质的影响.结果表明:牦牛乳酪蛋白的功能特性表现为酸和热的共同依赖性.在远离酪蛋白的变性温度(140℃)及pH 6.6附近,酪蛋白具有良好的溶解性、乳化性、热稳定性以及疏水性;当酸度达到6.8,温度接近其变性温度时,由于蛋白质分子变性程度增加,分子发生聚集,牦牛乳酪蛋白的溶解性、乳化性、热稳定性及疏水性较差.

不同加热温度对牦牛乳酪蛋白的影响

研究随着温度（30～90℃）的上升，牦牛脱脂乳和酪蛋白溶液的热稳定性、乳化性及浊度的变化，并运用扫描电镜观察在此过程中溶液中的酪蛋白胶束表面变化。结果表明：随着温度上升，由于乳清蛋白与酪蛋白的相互作用及酪蛋白自身发生离解、聚集过程，导致脱脂乳和酪蛋白溶液的热稳定性下降、乳化性降低、浊度增大，脱脂乳的增减幅度都明显大于酪蛋白溶液，在70℃以上尤为明显。其中在70～90℃时脱脂乳沉淀量由1.46%增至3.19%，酪蛋白溶液变化较小；乳化活力指数和乳化稳定性两者都随温度上升而降低；脱脂乳浊度在60℃以上显著增加（P＜0.05），酪蛋白溶液由0.28～0.33呈线性增加。

牦牛酪蛋白理化及功能特性的研究

研究了不同温度、pH值条件下牦牛酪蛋白的溶解度、表观黏度、疏水性以及乳化、发泡等功能特性。结果表明,在等电点范围之外,牦牛酪蛋白具有较理想的溶解性、乳化性、起泡性,其功能特性受pH值、温度影响较显著。

酰化和酶法修饰后牦牛乳酪蛋白热稳定性变化

采用酰化试剂和转谷氨酰胺酶(TG)对牦牛乳中的酪蛋白进行改性,并对改性后的酪蛋白进行热稳定性研究,通过在280nm处测定吸光度值来评价酪蛋白热稳定性。结果表明,酪蛋白经TG交联后热稳定性提高。采用不同酰化试剂修饰后,牦牛乳酪蛋白热稳定性增强,不同改性修饰的酪蛋白热稳定性差异较大,琥珀酸酐修饰酪蛋白热稳定性最强。结果可为牦牛乳酪蛋白修饰和产品开发及利用提供参考依据。

采用广义回归神经网络建立酪蛋白乳化性与疏水性关系

为了研究琥珀酰化修饰后酪蛋白乳化性与疏水性关系,该文以琥珀酰化牦牛乳酪蛋白为研究对象,分析了不同酰化程度酪蛋白乳化性及疏水性变化趋势,采用广义回归神经网络建立了牦牛乳酰化酪蛋白乳化性与疏水性关系模型。结果显示,琥珀酰化牦牛乳酪蛋白乳化性和疏水性均与酰化程度、pH值有关,pH值为5以上,随着酰化程度的增加,酪蛋白乳化活性增大;等电点附近,酪蛋白乳化活性较差,等电点之后乳化活性迅速增大。pH值介于2-6时,所有酪蛋白乳化稳定性较强,pH值介于6-11之间时,酪蛋白乳化稳定性差异较小,pH值为12时乳化稳定性有所增加。酪蛋白内荧光与1-苯胺基萘-8-磺酸(1-aniline napthalene-8-sulfonic acid,ANS)外源荧光最大荧光强度和最大发射波长随酰化程度及pH值变化表现出较为复杂的关系。通过广义回归神经网络(generalized-regression-neu-network,GRNN)建立了牦牛乳酪蛋白疏水性参数、pH值、酰化程度与乳化性关系,网络模型对乳化性的预测相对误差小于10%,预测结果良好。研究结果为酪蛋白乳化性研究提供了参考依据。

牦牛乳酪蛋白胶束琥珀酰化修饰研究

以琥珀酸酐为酰化试剂,牦牛乳酪蛋白为原料,对其进行了酰化修饰。系统研究了多种因素对酰化程度的影响,采用响应面法优化了修饰工艺,研究了酪蛋白乳化性变化。结果显示,牦牛乳酪蛋白胶束琥珀酰化修饰最佳条件为琥珀酸酐与酪蛋白配比0.6∶1(g/g),温度42℃,反应时间49min,pH8.8,酰化程度为86.01%。修饰后,牦牛乳酪蛋白的乳化稳定性和乳化活性分别提高了161.64%和98.54%。酪蛋白酰胺化修饰反应条件温和,易调节,修饰程度高,修饰酪蛋白的乳化性显著改善。该研究可为牛乳酪蛋白的酰化改性提供参考依据。

食品级牦牛“曲拉”干酪素生产工艺条件优化

【目的】为提高牦牛"曲拉"干酪素品质.【方法】通过L9(34)正交试验,以牦牛"曲拉"为原料,研究活性炭脱色和脂肪酶脱脂条件对"曲拉"精制干酪素品质的影响.【结果】"曲拉"精制干酪素活性炭脱色最佳工艺条件为脱色温度50℃,活性炭使用量2%,脱色时间40min;脂肪酶脱脂最佳工艺条件为脂肪酶体积分数1%,pH值为4.2,时间55min,温度35℃.经精制得到的干酪素成品为微白色粉末、有乳香味.蛋白质含量43.97%,脂肪25.75%,灰分5.59%,水分2.90%,酸度0.83%.【结论】经该工艺优化,"曲拉"干酪素成品颗粒细小,感官和理化指标理想,品质得到改善,产品质量符合要求.

牦牛乳酪蛋白酶解产物清除DPPH自由基活性分析

以牦牛(Bos grunniens)乳酪蛋白为原料,用胃蛋白酶、胰蛋白酶、碱性蛋白酶、木瓜蛋白酶和风味蛋白酶制备酪蛋白酶解产物,分别测定其DPPH自由基清除活力,发现碱性蛋白酶酶解产物的清除活力显著高于其他酶解产物(p<0.05)。测定不同水解时间点酪蛋白酶解产物的DPPH自由基清除活力,发现第7h酶解产物的清除活力显著高于其它水解时间点的样品(p<0.05)。还分析了碱性蛋白酶7h酶解产物的理化指标,发现其水解度、三氯乙酸氮溶解指数和蛋白质回收率均较高,表明此时大部分酪蛋白已降解,且酶解产物中短肽段的含量较高,用碱性蛋白酶制备具有DPPH自由基清除能力的酪蛋白酶解产物时得率较高,而其氨基氮含量相对较低,适宜作为保健食品功能性基料。

牦牛乳中主要过敏原的分离纯化

为研究牦牛乳蛋白质的过敏性,用化学方法分离牦牛乳中主要的过敏原蛋白质,采用快速蛋白纯化系统(FPLC)结合凝胶层析技术对分离出的蛋白质进行纯化.在牦牛脱脂乳中添加10%醋酸至酪蛋白的等电点pH4.6,使酪蛋白和乳清蛋白分离.根据酪蛋白在尿素溶液中的溶解度和对钙的敏感性不同,对酪蛋白进行粗分级,得到αs-酪蛋白和β-酪蛋白.应用离子交换色谱和葡聚凝胶sephadex G100进一步纯化粗分级得到的酪蛋白,得到αs-casein和β-酪蛋白.以柠檬酸钠为螯合剂、在低pH并有盐存在的条件下从酸乳清中分离出β-乳球蛋白,FPLC纯化后用RP-HPLC检测其纯度,得到αs-casein和β-酪蛋白纯度分别为87.13%和88.58%,β-乳球蛋白的纯度为80.00%.

天祝白牦牛α_(S1)-酪蛋白基因和κ-酪蛋白基因的PCR-RFLP研究

利用PCR—RFLP技术熏检测了天祝白牦牛αS1-酪蛋白(αS1-casein,αS1-CN)基因和κ-酪蛋白(κ-casein,κ-CN)基因部分序列的遗传多态性熏结果表明:天祝白牦牛群体αS1-CN基因表现单态,κ-CN基因存在遗传多态性。κ-CN基因PCR-RFLP位点等位基因A和B的基因频率分别为0.0745和0.9255。κ-CN基因PCR-RFLP位点的基因型分布符合Hardy-Weinberg平衡定理(P>0.05)。天祝白牦牛群体内平均基因一致度、基因多样度和有效等位基因数分别为0.9311、0.0689和1.0739。