小鼠卵黄囊间质干细胞的分离纯化及多向分化潜能的研究

目的 :分离、纯化小鼠卵黄囊间质干细胞 ,并观察其定向分化成骨、成软骨及成脂的潜能。方法 :分离、纯化孕 8.5d的小鼠卵黄囊间质干细胞 ,传代 4次后进行成骨、成软骨及成脂诱导。观察细胞形态 ,检测AKP ,Ⅰ ,Ⅱ ,Ⅲ型胶原及BMP - 1和BMP - 2的表达 ,并进行组化染色 ,检测成骨、成软骨及成脂情况。结果 :体外可获得纯化的卵黄囊间质干细胞 ,大小形态均一 ,呈梭形。成骨诱导后细胞向星形转化 ,AKP、Ⅰ型胶原、BMP - 2及VonKossa’s染色阳性 ,Ⅲ型胶原阴性。成软骨诱导后 ,细胞向多角形和圆形转化 ,AKP、Ⅱ型胶原、BMP - 1及Alcianblue染色阳性 ,Ⅰ型胶原阴性。成脂诱导后细胞肥大 ,油红O染色阳性。结论 :体外纯化的卵黄囊间质干细胞可诱导成骨、成软骨及成脂 。

卵黄囊干细胞向粒-单系造血祖细胞的定向诱导分化

目的 :观察卵黄囊干细胞向粒 单系造血祖细胞 (CFU GM )的定向诱导分化 ,稳定和优化检测卵黄囊CFU GM的方法。方法 :应用体外琼脂培养法 ,观察多种因素对小鼠卵黄囊干细胞形成粒 单系造血祖细胞集落形成单位的影响 ;应用染色压片法对所生成的集落性质作鉴定。结果 :植入不同数量的E7.5～ 8.5d的卵黄囊干细胞与CFU GM生成数量之间呈高度正相关 ;在接种相同数量的卵黄囊细胞数的情况下 ,DMEM培养体系生成的CFU GM数明显多于IMDM培养体系生成的集落数 (P <0 .0 1 ) ;马血清 (HS)组优于胎牛血清 (FBS)组 (P <0 .0 1 ) ;与GM CSF相比 ,WEHI 3条件培养液 (W3 CM)能明显促进卵黄囊CFU GM的生成 (P <0 .0 1 )。采用完整琼脂凝块压片法对卵黄囊细胞所形成的集落进行鉴定表明为粒 单系细胞集落。结论 :卵黄囊干细胞具有向CFU GM分化的能力 ;卵黄囊干细胞CFU GM诱导体系中各组分变化均可影响CFU GM的集落生成率 ;以DMEM ,GM CSF或W 3 CM ,HS为组分的体系可稳定地检测卵黄囊细胞CFU

小鼠卵黄囊间质干细胞向成骨细胞定向分化的实验研究

目的研究卵黄囊间质干细胞的成骨潜能。方法用０．１％的Ⅰ型胶原酶消化获得妊娠第８．５天的小鼠卵黄囊细胞；取贴壁细胞培养，并于接近融合时进行传代培养。对细胞进行形态学观察、碱性磷酸酶（ａｌｋａｌｉｎｅ ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ，ＡＫＰ）及Ⅰ、Ⅲ型胶原检测，传代４次后进行成骨诱导，每天观察细胞形态，并于培养７ｄ后测定ＡＫＰ、Ⅰ、Ⅲ型胶原及骨形态发生蛋白－２（ｂｏｎｅ ｍｏｒｐｈｏｇｅｎｅｔｉｃ ｐｒｏｔｅｉｎ－２，ＢＭＰ －２）的表达，培养８周后进行矿化检测。结果体外可获得纯化的卵黄囊间质干细胞，细胞大小形态均一，呈梭形，ＡＫＰ染色弱阳性，Ⅰ、Ⅲ型胶原阳性。在体外可诱导卵黄囊间质干细胞定向分化为多形性成骨样细胞，细胞由梭形向星形转化，并形成胞浆突起，相互连接成网状，细胞ＡＫＰ染色阳性，Ⅰ型胶原阳性，Ⅲ型胶原阴性，ＢＭＰ －２强阳性，８周后矿化区经Ｖｏｎ Ｋｏｓｓａ ＇ｓ染色呈阳性反应，符合成骨细胞的生物学特征。结论经体外纯化的卵黄囊间质干细胞可诱导向成骨细胞定向分化。

小鼠骨髓内皮细胞条件培养液体外扩增胚胎及成体造血干/祖细胞的差异及其机制探讨

本研究比较小鼠骨髓内皮细胞条件培养液 (mBMEC CM)联合FL和TPO对卵黄囊和骨髓造血干 祖细胞体外生长的影响 ,并对其机制进行探讨。取卵黄囊和骨髓单细胞悬液 ,对照组中加入含 10 %FBS的DMEM ,实验组分别加入 10 %mBMEC CM ,FL(5ng ml)和TPO(2ng ml) ,10 %mBMEC CM复合FL和TPO培养 2 4小时后进行集落培养 ,计数CFU GM和HPP CFC的集落数。应用AtlascDNAExpressionArray对卵黄囊和骨髓造血细胞表达的细胞因子受体进行检测。结果表明 :mBMEC CM能扩增卵黄囊和骨髓CFU GM和HPP CFC ,其与FL和TPO联合后扩增能力明显增强 ;mBMEC CM扩增骨髓CFU GM和HPP CFC的能力明显强于其扩增卵黄囊CFU GM和HPP CFC的能力。检测到小鼠卵黄囊及骨髓造血细胞存在差异表达的细胞因子受体 ;卵黄囊造血细胞表达PDGF Rβ ,PDGF Rα和促肾上腺皮质激素释放因子受体 ,而在骨髓造血细胞中未检测到上述受体的表达 ;在骨髓造血细胞中表达的IFN γR ,GM CSFR ,多巴胺D2受体和卵泡刺激素受体则未在卵黄囊造血细胞中检测到mRNA的表达。结论 :mBMEC CM能支持卵黄囊和骨髓造血祖细胞的体外扩增 ,其与FL和TPO联合后扩增能力明显增强 ;mBMEC CM对骨髓造血祖细胞表现出更强的扩增作用。

卵黄囊分化的研究进展

卵黄囊是一个由脏层和壁层卵黄囊构成的双层膜结构,其中存在多向分化潜能的造血干细胞;另外还发现卵黄囊能分化成其他组织类型,对卵黄囊的分化潜能分别进行讨论。

骨形态发生蛋白4在人胚胎卵黄囊造血过程中的表达

目的检测骨形态发生蛋白4（BMP-4）在卵黄囊造血期间的表达及其变化，探讨影响造血细胞早期形成、增殖和分化的调控机制。方法用药物流产受精3-8周胚胎57例，免疫组织化学SP法检测BMP-4、血管内皮生长因子受体2（KDR）、CD133、CD34在卵黄囊中的表达，RT-PCR分析转录因子Ihh、SCL、GATA-1、GATA-2和PU.1的表达。结果在16 d的卵黄囊血岛周边间质细胞BMP-4表达阳性，KDR低表达，CD34、CD133未见表达；21d时，BMP-4、CD34和CD133免疫反应产物均增加，染色增强；30d时，BMP-4、CD34、CD133和KDR表达最强，CD34阳性细胞沿血岛边缘形成血管样结构。45d时，BMP-4、CD34、CD133和KDR阳性细胞增多，中等程度染色；7周后，BMP-4、CD133、KDR、CD34阳性细胞明显减少，染色变弱。RT-PCR结果显示，不同时间的卵黄囊持续表达Ihh、SCL、GATA-1和GATA-2，而PU.1在16d时未见表达，此后有阳性表达。结论卵黄囊造血细胞的发育受BMP-4和转录因子的诱导和调节，卵黄囊造血不仅产生成血管血液干细胞，并能形成造血干细胞，说明卵黄囊不仅具有原始造血能力，而且可能具有长期造血能力。

大鼠胚胎卵黄囊内和腹腔内人脐血造血干细胞移植的比较

目的:探讨人脐血造血干细胞宫内移植的更好途径。方法:将人脐血单个核细胞注入大鼠胚胎的卵黄囊及胎鼠腹腔内,并设阴性及空白对照组,观察手术并发症及妊娠结局,待出生后1个月及2个月,分别用流式细胞仪和免疫组化检测移植情况。结果:胎鼠腹腔途径组的手术并发症发生率、胎鼠丢失率显著高于卵黄囊途径组(P<0.001,P<0.05)。出生后实验组仔鼠外周血中检测到逐渐增加的人CD3细胞,卵黄囊组的增殖量高于腹腔途径组(P<0.05)。卵黄囊组的种植率为89.7％,腹腔组的种植率为64.0％,二者比较有显著性差异(P<0.05)。出生后2个月在仔鼠的肝、脾及胸腺组织中均检测到人CD3、CD20及CD34^+阳性细胞,卵黄囊组的表达量明显高于腹腔组(P<0.001)。结论:大鼠胚胎的卵黄囊途径是人脐血造血干细胞进行宫内移植的一条较好途径。

不同造血微环境对诱导人胚胎干细胞向造血细胞分化的影响

目的:通过观察人卵黄囊基质细胞、人胎肝基质细胞和人胎骨髓基质细胞对人胚胎干细胞向造血细胞分化诱导效率,探讨不同造血微环境对造血发生的影响。方法:本实验诱导人胚胎干细胞分化为造血细胞的方法采用两步法:先用细胞因子培养形成5d的拟胚体,然后再模拟体内造血发生的微环境,分别用人卵黄囊基质细胞、人胎肝基质细胞和人胎骨髓基质细胞诱导拟胚体10d,通过流式细胞术检测细胞的flk,CD34和CD45表面抗原表达情况,观察3种基质细胞对人胚胎干细胞向造血细胞分化的影响。结果:5d拟胚体与卵黄囊基质细胞接触培养10d生成的细胞表达flk,CD34,CD45百分率分别1.80%±0.56%,1.30%±0.14%,1.05%±0.63%;与胎肝基质细胞接触培养10d生成的细胞表达为flk,CD34,CD45百分率分别为34.0%±25.45%,38.4%±24.8%,72.6%±25.7%;与骨髓基质细胞接触培养10d生成的细胞表达flk,CD34,CD45百分率分别为2.50%±1.48%,3.20%±0.56%,1.65%±0.21%;5d拟胚体自发分化10d生成的细胞表达flk,CD34,CD45百分率分别为0.30%±0.07%,0.65%±0.07%,0.15%±0.07%。与自发分化10d比较,3种基质细胞与5d拟胚体接触培养,均能够促进拟胚体向造血细胞的分化,且胎肝基质细胞诱导的效率显著优于其他两种基质细胞(P(0.05)。结论:与卵黄囊基质细胞和骨髓基质细胞比较,胎肝基质细胞更有利于诱导人胚胎干细胞向造血细胞的分化。

人卵黄囊间质干细胞的分离纯化及诱导成脂的实验研究

目的 :分离纯化及体外定向诱导人卵黄囊间质干细胞 (YS -MSC)分化为脂肪细胞。方法 :显微分离人卵黄囊 ,经酶消化得到卵黄囊细胞 ,卵黄囊细胞经贴壁培养、传代纯化得到人YS -MSC ,流式细胞仪检测YS -MSC表面抗原表达 ,钙钴法测定碱性磷酸酶 (AKP)活性 ;地塞米松、消炎痛、胰岛素定向诱导YS -MSC分化为脂肪细胞。油红O检测中性脂肪。结果 :人卵黄囊间质干细胞易于分离、纯化 ,体外培养增殖潜能大。卵黄囊间质干细胞CD2 9、CD4 4、CD16 6及CD10 5表达阳性 ,CD34、CD4 5和CD86为阴性 ;AKP弱阳性。卵黄囊间质干细胞经成脂诱导转化为大小不等的园形或椭圆形细胞 ,可见胞浆内有少量微小脂滴形成 ,随时间延长 ,胞浆中脂滴相互融合 ,胞核被挤于细胞的一侧 ,经油红O染色脂滴染橘红色 ,符合脂肪细胞的生物学特征。结论 :人卵黄囊间质干细胞与成体间质干细胞表型一致 ,在体外可以分化为脂肪细胞。

小鼠胚胎早期血细胞发生的研究进展

根据时空上的不同,小鼠胚胎发育时期的血细胞发生目前被分为原始造血、红系/髓系祖细胞(EMPs)的产生和造血干细胞(HSCs)成熟并分化为各种血细胞3个阶段。最新的观点也把原始造血和EMPs的产生归结为非HSCs依赖性的血细胞谱系分化阶段,将第3阶段称为HSCs依赖性的血细胞谱系分化阶段。尽管胚胎时期的血细胞发生涉及多个造血器官,但本文中我们主要对近年在细胞和分子水平进行的造血细胞和HSCs在卵黄囊和腹主动脉-性腺-中肾(AGM)区发育的研究进行归纳总结,以此展示新近发现的胚胎发育早期血细胞发生的特点及其潜在机制。

骨髓间充质干细胞向造血细胞分化的体外诱导体系构建及优化

目的构建模拟胚胎期不同造血部位的造血微环境体系用于体外诱导骨髓间充质干细胞(BMSC)向造血细胞分化,并初步评价分化效率。方法采用体视显微镜及HE染色观察E11.5小鼠胚胎卵黄囊(YS)、胎盘(PL)和胎肝(FL)的解剖部位和形态;选取E7.5~E9.5、E10.5~E12.5及E13.5~E15.5胚胎YS、PL和FL组织进行基质细胞培养并制备条件培养液,即为卵黄囊基质细胞条件培养液(YSSC-CM)、胎盘基质细胞条件培养液(PLSC-CM)和胎肝基质细胞条件培养液(FLSC-CM),与体外扩增的SD大鼠BMSC共培养。实验分为对照组、白细胞介素6(IL-6)联合干细胞因子(SCF)处理组、YSSC-CM处理组、PLSC-CM处理组和FLSC-CM处理组。共培养7~9 d,收集培养液中漂浮细胞。吉姆萨染色检测细胞形态,直接免疫荧光术检测细胞表面特异性分子CD34和CD45的表达,集落形成实验检测粒-巨噬细胞集落形成单位(GM-CFU)鉴定分化细胞。结果体视显微镜下观察鼠胚PL和FL与人胚的位置相同,而YS是包裹在胚体及羊膜的外侧,HE染色显示PL血管迷路、FL血窦和YS血岛富含血细胞;倒置相差显微镜及细胞计数结果显示,与空白对照组及IL-6联合SCF处理组相比,YSSC-CM组、PLSCCM组和FLSC-CM组培养液中的漂浮细胞明显增多,FLSC-CM组最多;YSSC-CM组、PLSC-CM组和FLSC-CM组漂浮细胞,经吉姆萨染色后形态类似于淋巴或单核样细胞,表达造血细胞特异性表面标志CD34和CD45,形成造血集落数最多是FLSC-CM组,其次是PLSC-CM组,最少为YSSC-CM组。而对照组和IL-6联合SCF处理组无变化。结论依循阶段性和时序性,获取YS、PL和FL并制备了YSSC-CM、PLSC-CM和FLSC-CM,可诱导SD大鼠BMSC向造血细胞分化,FLSC-CM处理的细胞分化效率较优。

小鼠卵黄囊间充质干细胞的培养及鉴别

目的研究小鼠卵黄囊间充质干细胞(YS-MSCs)的分离、培养和鉴定。方法显微分离妊娠10d的小鼠胚胎卵黄囊,经0.1%的Ⅰ型胶原酶消化1h得到卵黄囊细胞,取贴壁细胞培养,并于接近汇合时进行传代培养,透射电镜下观察YS-MSCs的超微结构;流式细胞仪检测YS-MSCs表面标志;钙钴法测定YS-MSCs碱性磷酸酶(AKP)活性;细胞组织化学检测YS-MSCs化学变化;地塞米松、胰岛素定向诱导YS-MSCs分化为脂肪细胞,油红O检测中性脂肪。结果体外可获得YS-MSCs,细胞大多数呈梭形;透射电镜下YS-MSCs表面有微绒毛,胞浆中有丰富的线粒体、粗面内质网、高尔基复合体;核大,形态不规则;流式细胞术分析YS-MSCs免疫表型显示,原代和第1代YS-MSCs均为CD44、CD105阳性,CD34也有少量表达;细胞化学YS-MSCs PAS-过碘酸雪夫染色阳性,苏丹黑-B(SB)及碱性磷酸酶(AKP)染色阴性;YS-MSCs经成脂诱导后,胞浆中有脂滴形成,经油红O染色脂滴呈鲜红色。结论小鼠YS-MSCs的生物学特性与成体间充质干细胞相似,且更为原始,提示其可作为组织工程的种子细胞来源。

碱性成纤维细胞生长因子在胚胎卵黄囊造血过程中的表达

目的探讨人胚胎发育过程巾碱性成纤维细胞生长因子1（FGF1）对造血细胞形成的影响，研究FGF1、血管内皮生长因子受体（KDR）、CD133、CD34和转录因子Ihh、SCL、GATA—1、GATA-2和Pu、1在卵黄囊中的表达，了解FGF1、造血细胞和转录因子在胚胎造血过程中的作用和关系。方法采用药物流产孕3～12周人胚胎，冰冻切片，免疫组织化学SP染色，并应用分析软件进行分析，同时进行造血相关转录因子RT—PCR扩增分析。结果孕3～12周人胚卵黄囊血岛均由外周的血管内皮细胞和中心的造血细胞组成。在16d的卵黄囊中脏壁中胚层围血岛周边表达FGF1阳性产物，而血岛内少有FGF1表达，低表达KDR，不表达CD34、CD133；21d上述抗体均有表达，灰度值减少，染色增强；30d时在血岛和中胚层发现强染色CD34^＋、CD133^＋和KDR^＋细胞，灰度值分别由156±16、173±18和160±14降低为53±7、52±6和69±8；FGF1呈强阳性表达，灰度值由161±13急降至40±5，达到最低值。有些阳性细胞沿血岛边缘形成血管样结构。45d时中等程度表达CD34、CD133、KDR细胞数量增多，细胞聚集成团分布于血岛中；FGF1阳性细胞也多聚集分布在血岛中，中胚层少有分布，灰度值增加。7周后CD133^＋、KDR^＋、CD34^＋细胞明显减少，灰度值增加，染色变浅，卵黄囊弱表达FGF1，灰度值增加为179±22。RT—PCR结果显示，不同时间的卵黄囊均表达Ihh、SCL、GATA—1和GATA-2，PU.1在16d不表达，此后表达。结论卵黄囊造血细胞的发育受FGF1和转录因子的诱导和调节，提示FGF1介导的信号通路对造血中胚层模式的形成、成血管血液干细胞的扩增以及造血干细胞的动态平衡具有重要意义。FGF通路可能通过调节GATA1等转录因子表达水平和活性来调控卵黄囊造血。

卵黄囊造血分化调控的研究进展

卵黄囊是哺乳动物发育过程中最早的造血器官,卵黄囊造血干细胞(YS-HSC)具有多向分化的潜能,可能是成年造血干细胞的来源。YS-HSC的增殖、分化受多种细胞因子和黏附分子等因素的影响,是一个涉及多基因调控的复杂过程。本文就卵黄囊造血及YS-HSC的增殖、分化及其调控机制的研究进展作一综述。

敲除GPS2基因对小鼠胚胎原始造血的影响

目的明确敲除G蛋白通路抑制因子2(GPS2)基因对小鼠胚胎原始造血的影响。方法分离GPS2敲除小鼠胚胎外周血细胞,利用瑞氏吉姆萨染色观察血细胞形态,流式细胞术分析原始红细胞分化情况;分离敲除小鼠卵黄囊细胞,利用集落形成实验分析造血分化能力,流式细胞术分析造血干细胞的产生。结果GPS2敲除胚胎外周血部分原始红细胞细胞膜皱缩、形态畸形,未成熟原始红细胞(CD71^+Ter119^-)比例明显提高。GPS2敲除与野生型卵黄囊中造血干细胞比例基本相同,产生红系集落形成单位(CFU-E)、红系爆式集落形成单位(BFU-E)、粒细胞巨噬细胞集落形成单位(CFU-GM)及混合集落形成单位(CFU-GEMM)等集落的数量无明显差异。结论敲除GPS2不影响卵黄囊造血干细胞产生及集落形成,但抑制原始红细胞的分化成熟并导致原始红细胞形态畸形。