抗鸡传染性贫血病毒VP2蛋白单克隆抗体的制备及其应用研究

为制备针对鸡传染性贫血病毒(Chicken infectious anemia virus,CIAV)的单克隆抗体,以CIAV的VP2原核表达蛋白作为抗原免疫小鼠,经杂交瘤技术获得3株能稳定分泌抗VP2蛋白特异性抗体的细胞株,进一步经IFA筛选出特异性和灵敏度俱佳的杂交瘤细胞Mab-VP2-4株,制备的小鼠腹水效价达到1∶2000。结果显示,制备的抗VP2蛋白单克隆抗体可与多株CIAV感染的MDCC-MSB1细胞发生特异性反应,而对EDSV、ALV、ILTV、ARV以及空白MDCC-MSB1细胞、CEF细胞等均无交叉反应,特异性良好,且应用于IFA方法时对CIAV感染的最低检出限为5 TCID 50。以该单克隆抗体对市场上10种不同来源的禽活疫苗进行病毒分离结合单克隆抗体IFA检测,同时与《中国兽药典》规定的鸡检查法进行对比检测,结果一致,均未检出CIAV污染。本研究制备了针对CIAV VP2蛋白的特异性单克隆抗体,为该病特异性诊断方法的建立奠定了基础。

鸭源新型鹅细小病毒的分离鉴定及VP2蛋白的原核表达

为了获得鸭源新型鹅细小病毒(NGPV)流行毒株并表达VP2蛋白,试验采集患短喙侏儒综合征的死亡鸭肝脏组织病料样本,首先通过鸭胚传代培养分离病毒,然后对分离毒株进行血凝试验、PCR检测、鸭胚半数致死量(ELD_(50))测定及致病性试验,最后对VP2蛋白进行诱导表达、可溶性分析、纯化及Western-blot鉴定。结果表明:从临床病料样本中分离到1株病毒,将该毒株接种鸭胚,鸭胚的死亡时间均集中在接种后的第48~72小时之间,死亡鸭胚出现绒毛尿囊膜增厚、胚体有大量出血点、鸭喙短小等短喙侏儒综合征的典型病变特征,将分离毒株命名为SCNC01株。SCNC01株不能凝集1%鸡红细胞,在其基因组DNA中可扩增出NGPV NS1基因序列,该序列与GenBank中的NGPV NS1基因序列相似性在90.6%~98.3%之间,SCNC01株与MK000549、MN415966、JF333590、KC996729、KT598506、MW929338等NGPV毒株处于同一分支,确定该毒株为NGPV。SCNC01株的ELD_(50)为1×10^(-4.5)/0.2 mL,可引起雏鸭出现运动障碍、食欲下降、精神萎靡、喙萎缩、舌头外翻、排白色稀便等临床症状甚至死亡。经IPTG诱导NGPV VP2蛋白获得了表达,且表达形式为包涵体,经His-Tag蛋白纯化柱纯化后,出现与目的蛋白大小一致的单一条带,该蛋白能与NGPV阳性血清特异性结合,具有良好的反应原性。说明试验成功分离到1株鸭源NGPV,并获得了具有良好反应原性的VP2蛋白。

密码子优化的RHDV2双VP60基因重组杆状病毒构建及表达蛋白免疫原性分析

[目的]试验旨在优化兔出血症病毒2型(Rabbit hemorrhagic disease virus 2,RHDV2)病毒样颗粒(virus-like particle, VLP)疫苗的制备策略,探究RHDV2 VLP疫苗对家兔的免疫原性,为低成本、高产量RHDV2新型疫苗研发提供新思路。[方法]根据昆虫细胞的密码子偏好性优化合成RHDV2 VP60全基因,将双VP60基因插入真核载体pFastBacTMDual,转化携带Bacmid质粒的大肠杆菌DH10Bac感受态细胞,构建含双VP60基因的重组杆粒Bacmid-VP60-VP60,转染Sf9昆虫细胞,通过Western blotting、间接免疫荧光试验(IFA)及透射电镜对重组杆状病毒Bacmid-VP60-VP60进行表达验证;将优化策略制备的重组蛋白抗原与氢氧化铝佐剂按照9∶1比例制备VLP灭活疫苗,通过安全性检验、最小免疫剂量、免疫持续期等评估优化策略制备的RHDV2 VLP疫苗的保护效果。[结果]试验成功构建重组杆粒Bacmid-VP60-VP60。Western blotting鉴定结果显示,重组杆状病毒转染Sf9细胞表达出大小约60 ku的RHDV2 VP60蛋白。IFA鉴定结果显示,感染重组杆状病毒的Sf9细胞产生了大量的黄绿色荧光,表明重组杆状病毒在Sf9细胞中大量表达VP60蛋白。透射电镜观察结果显示,VP60蛋白折叠成VLP,大小为40 nm左右,呈现球形结构,表面光滑。优化策略制备的RHDV2 VLP疫苗对家兔具有良好的安全性和免疫原性,最小免疫剂量为0.5 mL/只,免疫持续期可达210 d以上。[结论]试验构建了含有密码子优化的双VP60基因的重组杆状病毒,并在昆虫细胞中成功表达RHDV2 VP60蛋白,该蛋白制备的VLP疫苗对家兔具有良好的免疫原性。

A型塞内卡病毒VP2蛋白多克隆抗体的制备及间接ELISA检测方法的建立

[目的]制备A型塞内卡病毒(Senecavirus A,SVA)VP2蛋白多克隆抗体,建立检测SVA抗体的间接ELISA方法,以期为SVA致病机制及诊断提供研究基础。[方法]利用同源重组技术将VP2基因克隆至原核表达载体pET-28a中,构建重组表达质粒pET-28a-VP2,并转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞进行IPTG诱导表达,表达产物经纯化后皮下多点注射新西兰大白兔制备多克隆抗体。利用间接免疫荧光试验(IFA)、Western blotting和中和试验鉴定多克隆抗体的特异性、反应性和中和活性。以VP2为抗原包被酶标板,通过矩阵优化、临界值确定、特异性鉴定及敏感性和重复性分析建立检测SVA抗体的间接ELISA方法。采集50份临床血清样品,分别用间接ELISA与IFA方法进行检测,分析间接ELISA方法的符合率。[结果]重组VP2蛋白以包涵体形式表达,大小为40 ku。制备的多克隆抗体能与重组VP2蛋白和SVA特异性结合,与其他病毒无交叉反应,且具有较高的中和活性。经对间接ELISA条件的优化,确定VP2包被浓度为4μg/mL,阳性血清稀释浓度为1∶250,封闭液为5%脱脂乳+5%BSA,血清样品和二抗孵育时间均为90 min, TMB底物反应时间为10 min,临界值为0.182。建立的间接ELISA方法与常见的猪病毒阳性血清不反应,与IFA符合率达94.0%。[结论]原核表达系统表达的VP2蛋白具有良好的免疫原性,制备的多克隆抗体能与SVA和VP2发生特异性反应。建立的间接ELISA方法特异性高,与IFA符合率高,适用于临床SVA抗体检测和疫苗效力评价。

Fe、Ir掺杂MoS_(2)表面对N_(2)气敏吸附与解离反应性能提升的第一性原理研究

基于第一性原理方法,采用周期性平板模型,研究了N_(2)分子在掺杂体系TM-MoS_(2)(TM=Fe、Ir)表面的吸附和解离行为.研究表明:N_(2)分子在TM-MoS_(2)(TM=Fe、Ir)表面吸附能依次为0.62和0.47 eV,而完整MoS_(2)表面的吸附能只有0.08 eV,说明掺杂之后对N_(2)表现出略好的吸附性能.差分电荷密度分析表明,N_(2)吸附后,掺杂Fe、Ir原子与两个N原子之间电荷有所增加,N-N键之间的区域电荷密度减少,N-N键的强度减弱.态密度计算结果发现,N_(2)在吸附过程中,主要是N原子的2p_(y)、2p_(z)轨道与Ir的5d_(xy)和5d_(z^(2))以及Fe的3d_(xy)和3d_(z^(2))发生杂化作用.通过分析解离活化能,N_(2)在掺杂体系TM-MoS_(2)(TM=Fe、Ir)表面解离需要活化能均较高,且远大于在相应掺杂表面的吸附能,说明N_(2)在掺杂体系TM-MoS_(2)(TM=Fe、Ir)表面解离应该表现为分子吸附或脱附.

芝麻过敏原Ses i 2核酸适体的筛选与鉴定研究

芝麻是八大类食物过敏原之一,快速准确识别芝麻过敏原对预防其过敏有重要意义。核酸适配体可以高效识别靶标过敏原,在过敏原检测中有良好的应用前景。为了获得芝麻主要过敏原Ses i 2的特异性核酸适体,本研究以Ses i 2为靶标,通过磁珠筛选法(磁珠-SELEX)开展10轮筛选,经由高通量测序获得6条候补序列(S1~S6),并进行家族性、同源性分析及二级结构预测。结果表明,6条候选核酸适体的重复率可达46.38%,其自由能在-9.02到-2.47 kcal·moL^(-1)之间,根据自由能能量稳定原则,S1和S5吉布斯自由能最低最稳定,分别为-6.70和-9.02 kcal·moL^(-1)。利用ELISA试验进行亲和力测试,结果表明核酸适体S1和S2的亲和能力较强,S1:KD=67.02 nmol·L^(-1),R2=0.925 8,S2:KD=97.65 nmol·L^(-1),R2=0.795 1。核酸适体S1与过敏原Ses i 2的结合力和其他过敏原蛋白相比有显著差异,可视为具有特异性。本研究最终获得一条兼具良好亲和力和特异性的核酸适体S1,为芝麻过敏原快速检测提供了技术支撑。

铀对α-Al_(2)O_(3)中氢与本征点缺陷相互作用的影响

在长期高温服役过程中,铀床的氚渗透泄露问题是聚变堆涉氚系统中需要关注的焦点之一,而一种行之有效的解决思路是在内壁制备阻氚涂层.然而,服役过程中通过热扩散渗入涂层内部的铀可能在阻氚涂层氢行为中起作用,进而影响其服役可靠性.基于此,采用第一性原理计算方法,研究了铀对α-Al_(2)O_(3)中氢与本征点缺陷相互作用的影响.结果发现,铀对α-Al_(2)O_(3)中空位型本征点缺陷及氢相关缺陷的存在形式、电荷态及相对稳定性有重要影响.从形成能观点来看,铀对α-Al_(2)O_(3)中空位型本征点缺陷及氢相关缺陷的形成有利,且α-Al_(2)O_(3)中空位型点缺陷对氢的捕陷能力因铀的引入显著增加.研究结果对α-Al_(2)O_(3)基内壁阻氚涂层在氚工艺系统铀床中应用的可靠性评估具有重要的指导意义.

C反应蛋白/白蛋白比值对2型糖尿病合并急性心肌梗死患者远期不良心脑血管事件的预测价值研究

背景急性心肌梗死(AMI)是威胁全球公众健康的主要原因之一。虽然已有相应的再灌注治疗策略,但AMI相关的主要不良心脑血管事件(MACCEs)仍然是全世界人口死亡的原因之一。尤其合并糖尿病的AMI患者,因冠状动脉病变复杂,病变程度严重,尽早发现和判断该部分患者远期预后相对困难,因此寻找相对简便、易获得的实验室指标,有利于为2型糖尿病(T2DM)合并AMI患者经皮冠状动脉介入(PCI)术后MACCEs的预测提供依据。目的探讨血清C反应蛋白(CRP)/白蛋白(Alb)比值(CAR)对T2DM合并AMI患者PCI术后远期MACCEs的预测价值。方法纳入2014—2019年就诊于宁夏医科大学总医院心血管内科1683例T2DM合并AMI患者为研究对象,收集患者的一般临床资料与检查结果。对所有患者进行电话或门诊随访,以全因死亡、非致死性心肌梗死、再发不稳定型心绞痛、非致死性脑卒中、新发心力衰竭或心力衰竭加重再入院、再次血运重建作为MACCEs。根据患者随访期间是否发生MACCEs分为MACCEs组(508例)和非MACCEs组(1175例)。采用单因素及多因素Logistic回归分析探讨T2DM合并AMI患者MACCEs事件的影响因素。采用Kaplan-Meier法绘制患者的生存曲线,生存曲线的比较采用Log-rank检验。采用受试者工作特征(ROC)曲线分析CAR对T2DM合并AMI患者远期发生MACCEs的预测效能,使用净重分类改善指标(NRI)和综合判别指数(IDI)评价CAR对T2DM合并AMI患者预后评估的改善效果。结果1683例患者中508例(30.18%)患者发生MACCEs。多因素Logistic回归分析显示高血压病[OR(95%CI)=1.994(1.142~3.483)]、冠状动脉植入支架长度[OR(95%CI)=1.031(1.002~1.062)]、CRP[OR(95%CI)=0.950(0.915~0.986)]、Alb[OR(95%CI)=0.933(0.880~0.989)]及CAR[OR(95%CI)=5.582(1.705~18.277)]是T2DM合并AMI患者PCI术后发生MACCEs的影响因素(P<0.05)。根据CAR中位表达水平(0.86),将患者分为CAR<0.86组和CAR≥0.86组,Log-rank检验结果显示,CAR≥0.86组MACCEs发生率高于CAR<0.86组(52.68%与22.92%;χ^(2)=65.65,P<0.001)。ROC曲线显示CAR预测T2DM合并AMI患者发生MACCEs的ROC曲线下面积为0.728(95%CI=0.702~0.754),最佳截断值为0.576,灵敏度为0.617,特异度为0.747。在基线模型基础上,与CRP、Alb相比,CAR能明显改善对患者发生MACCEs的预测效果(NRI=0.377,IDI=0.166,C指数=0.690;P<0.05)。结论CAR是T2DM合并AMI患者PCI术后远期MACCEs发生风险的有效预测指标。

高三酰甘油血症-腰围表型与2型糖尿病发病风险:一项前瞻性队列研究

背景高三酰甘油血症-腰围表型是2型糖尿病(T2DM)的风险因素,不同性别、不同地区、不同年龄段及超重/肥胖人群中T2DM发病风险可能不同。目的探讨不同性别、不同地区、不同年龄段及超重/肥胖人群高三酰甘油血症-腰围表型与T2DM发病风险的关系,为糖尿病防控提供科学依据。方法本研究为前瞻性队列研究,2010年采取分层整群随机抽样方法,以贵州省12个县(市、区)18岁及以上9280名常住居民为队列人群进行基线调查。于2016—2020年进行随访,共随访到8163人,剔除基线时糖尿病患者、相关指标信息缺失者、失访和死亡的对象,最终纳入6743名调查对象。根据基线腰围(WC)和血清三酰甘油(TG)水平将调查对象分为4组,正常腰围和正常血清三酰甘油(NWNT)组:男性腰围<90 cm或女性腰围<85 cm、血清三酰甘油<1.7 mmol/L;正常腰围和高血清三酰甘油(NWHT)组:男性腰围<90 cm或女性腰围<85 cm、血清三酰甘油≥1.7 mmol/L;腰围增大和正常血清三酰甘油(EWNT)组:男性腰围≥90 cm或女性腰围≥85 cm、血清三酰甘油<1.7 mmol/L;腰围增大和高血清三酰甘油(EWHT)组:男性腰围≥90 cm或女性腰围≥85 cm、血清三酰甘油≥1.7 mmol/L。采用Cox比例风险回归模型分析高三酰甘油血症-腰围表型分组与新发T2DM之间的关系。结果中位随访时间6.58年,6743名调查对象中新发T2DM 706例,发病率为10.47%。在调整了相关的混杂因素后,Cox比例风险回归分析显示,EWHT组T2DM发病风险是NWNT组的1.486倍(HR=1.486,95%CI=1.185~1.865,P=0.001)。亚组多因素Cox比例风险回归分析显示,在男性、农村、年龄<45岁、超重/肥胖人群中,EWHT组T2DM发病风险分别是NWNT组的1.792倍(HR=1.792,95%CI=1.297~2.476,P<0.001)、1.483倍(HR=1.483,95%CI=1.115~1.971,P=0.007)、1.540倍(HR=1.540,95%CI=1.083~2.190,P=0.016)、1.614倍(HR=1.614,95%CI=1.123~2.321,P=0.010)。结论对大样本人群进行中位随访6.58年后,高三酰甘油血症-腰围表型是贵州省T2DM的发病风险,在男性、农村、年龄<45岁、超重/肥胖人群中更为显著。因此,对这类人群应该加强健康教育,通过合理饮食、适当运动从而控制体质量,降低血清三酰甘油水平是预防T2DM发病的必要手段和有效的方法。

lncRNA-BBOX1-2通过调控成纤维细胞生长因子受体1促进胃癌的发生和发展

目的探讨长链非编码RNA(long non-coding RNA,lncRNA)BBOX1-2通过调控成纤维细胞生长因子受体1(fibroblast growth factor receptor 1,FGFR1)对胃癌的发生发展机制的影响。方法回顾性选取2017年4月至2019年1月于上海交通大学医学院附属瑞金医院卢湾分院接受胃癌根治术30例病人肿瘤组织及癌旁相应正常组织作为研究对象,采用实时定量PCT(real-time PCR,RT-PCR)检测lncRNA-BBOX1-2和FGFR1表达;si-linc-BBOX1-2转染SGC-7901细胞后,通过蛋白质印迹法/细胞存活率分析(MTT)、细胞迁移和侵袭(Transwell)实验、细胞划痕、平板克隆一系列生物学功能实验,检测肿瘤细胞生物学功能及FGFR1表达的变化。结果胃癌组织中的lncRNA-BBOX1-2(3.68±0.58比1.15±0.11)和FGFR1(4.26±0.71比1.19±0.18)表达显著高于癌旁正常组织(P<0.05);si-linc-BBOX1-2转染SGC-7901细胞后,FGFR1表达下调,细胞活力、迁移、侵袭和生存能力明显下降。结论LincRNA-BBOX1-2可通过调控FGFR1的表达介导胃癌细胞的增殖、凋亡、迁移和侵袭,可能为胃癌的治疗提供了新的靶点和潜在的生物学标志物。

响应面法优化信号分子AI-2合成蛋白LuxS表达条件

群体感应是一种由自诱导物(autoinducers,AIs)介导的、细菌密度依赖的基因表达调控方式,已经被证实参与细菌多种生理功能的调控.信号分子AI-2介导的LuxS/AI-2型群体感应系统广泛存在于革兰氏阳性和阴性细菌,并备受关注.AI-2的合成依赖于S-核糖同型半胱氨酸酶(LuxS)的催化作用,而LuxS蛋白则是由luxS基因经过转录、翻译得到的.为了探索LuxS蛋白在表达菌株Escherichia coli BL21(DE3)中的最佳表达条件,从而获得较高产量且具有一定的生物活性的LuxS蛋白.首先对LuxS蛋白结构进行预测,确定E.coli BL21(DE3)作为表达菌株.其次,在单因素优化的基础上,进一步通过响应面法优化LuxS蛋白的表达条件.在菌液浓度OD 600为0.5、诱导温度为37℃、IPTG浓度为0.5 mmol/L、诱导时间为31 h条件下,获得LuxS蛋白的最高表达量.研究成功优化了LuxS蛋白在E.coli BL21(DE3)中的诱导表达条件,获得了具有生物活性的LuxS蛋白,并在后续的研究中成功合成了具有生物活性的信号分子AI-2,为体外合成AI-2奠定了基础.

辽宁沈阳株猫泛白细胞减少症病毒VP2基因扩增及生物信息学分析

【目的】通过生物信息学方法分析1株2022年辽宁沈阳地区猫泛白细胞减少症病毒(Feline panleukopenia virus, FPV)LN3株VP2蛋白的分子特征。【方法】利用FPV胶体金试纸条对临床上表现呕吐、腹泻等症状的患病猫粪便进行检测,提取该病猫粪便的病毒DNA进行FPV VP2基因PCR扩增及测序,使用Seqman软件对序列进行拼接。将所获序列与NCBI数据库中FPV和犬细小病毒(Canine parvovirus, CPV)的VP2基因进行相似性比对及遗传进化分析。使用生物信息学软件对该毒株VP2蛋白进行预测,包括理化性质、亲/疏水性、跨膜区、糖基化位点、亚细胞定位、二级结构、三级结构等。【结果】FPV LN3株VP2基因全长1 755 bp,编码584个氨基酸;与GenBank上登录的15株FPV同属一个大分支,相似性为98.9%~99.7%;与CPV处于不同分支上。生物信息学软件预测显示,FPV LN3株VP2蛋白为亲水性蛋白,无跨膜结构;含有7个潜在N-糖基化位点、86个O-糖基化位点和50个磷酸化位点;VP2蛋白在细胞质、细胞核、线粒体中的可能性分别为43.5%、34.8%和21.7%;VP2蛋白二级结构中无规则卷曲、α-螺旋、延伸链、β-转角分别占61.82%、8.90%、24.32%及4.97%,三级结构预测结果与其一致;VP2蛋白共有20个抗原表位。【结论】VP2是FPV遗传变异的关键基因,FPV LN3株VP2蛋白属于亲水性、非跨膜稳定蛋白,共存在20个抗原表位。试验结果为进一步研究FPV VP2蛋白功能及研发新型疫苗提供理论依据。

内皮细胞特异性骨形态发生蛋白2对血管新生的影响:生物信息学分析和实验验证

背景:血管新生是心血管疾病的主要干预靶点,骨形态发生蛋白2具有调控血管新生作用,但内皮细胞特异性骨形态发生蛋白2对血管新生的调控作用不清楚。目的:探讨内皮细胞特异性骨形态发生蛋白2对血管新生的影响。方法:(1)生物信息学分析:通过Panglao DB公共基因表达数据库单细胞转录组荟萃分析观察骨形态发生蛋白2细胞群表达丰度和定位。血管新生小鼠和内皮(心内膜)过表达骨形态发生蛋白2小鼠转录组测序数据集探索内皮细胞骨形态发生蛋白2对血管新生信号通路的调控作用。(2)体内实验验证:建立小鼠后肢缺血模型,对比模型小鼠患侧与健侧缺血后肢7,14和21 d血流灌注情况,免疫荧光和免疫组织化学染色评估小鼠骨形态发生蛋白2和CD31的表达定位情况。(3)体外实验验证:体外培养人脐静脉内皮细胞,分为对照组、缺氧组和骨形态发生蛋白2抑制剂(Noggin蛋白)干预组,培养24 h,观察各组内皮细胞血管新生情况。结果与结论:(1)内皮细胞是表达骨形态发生蛋白2的重要细胞亚群,在血管新生内皮细胞和骨形态发生蛋白2过表达内皮细胞转录组再分析均发现骨形态发生蛋白2表达明显升高,血管新生通路明显激活。(2)缺血7 d小鼠新生血管周围骨形态发生蛋白2阳性血管明显增加(P<0.05),缺血2周骨形态发生蛋白2阳性血管明显减少(P<0.001)。(3)体外培养人脐静脉内皮细胞,缺氧干预后,内皮细胞迁移能力和血管出芽明显增加,血管新生因子血管内皮生长因子和血小板衍生生长因子的表达明显升高,Noggin明显减少了缺氧诱导的内皮细胞血管新生(P<0.001),并下调血管内皮生长因子和血小板衍生生长因子的表达(P<0.01)。(4)结果证实,内皮细胞特异性骨形态发生蛋白2具有调控血管新生作用,靶向性内皮细胞骨形态发生蛋白2可望改善血管新生。

犬源细小病毒兰州株的分离鉴定与VP2基因的遗传进化分析

为了解近年来甘肃省兰州市犬细小病毒(Canine parvovirus,CPV)的基因型分布情况及遗传进化方向,于兰州市宠物医院采集8份细小病毒阳性(试纸条检测)的犬粪便样品,使用F81细胞分离病毒;利用PCR、间接免疫荧光试验、血凝试验鉴定所分离的病毒;随后分析病毒基因型和VP2基因的遗传进化关系。结果显示,共分离得到7株细小病毒,1株为New CPV-2a型CPV,5株为CPV-2c型CPV,1株为猫细小病毒(Feline parvovirus,FPV)。VP2氨基酸序列同源性及进化分析结果显示,分离到的CPV-2c型毒株VP2同源性为100%,与北京、江苏等地分离株的亲缘关系较近;New CPV-2a型毒株与吉林、西安等地的分离株亲缘关系较近;犬源猫细小病毒(LZ05)与已报道的FPV毒株相比,存在91S→A、322V→T独特的突变,且与2020年北京一株犬源猫细小病毒分离株亲缘关系最近。

抗传染性法氏囊病毒VP2蛋白单克隆抗体的制备及鉴定

传染性法氏囊病(infectious bursal disease,IBD)是由传染性法氏囊病毒(Infectious bursal bursal virus,IBDV)引起的一种高度传染性疾病,以雏鸡法氏囊萎缩、腿肌出血等为特征性病变,给世界家禽产业造成重大经济损失。目前,由新型变异株引起的IBD在我国呈现流行趋势。为建立基于IBDV VP2蛋白的免疫学诊断技术,本研究以新型变异毒株IBDV-LY21/2为模板,扩增其VP2基因,随后构建重组原核表达质粒pCold-Ⅰ-IBDV-VP2并转化BL21(DE3)大肠杆菌进行诱导表达,通过考马斯亮蓝染色和Western blot检测重组蛋白His-VP2的表达情况,并对其进行纯化和浓度测定。将His-VP2免疫BALB/c小鼠后,采用iELISA检测血清抗体效价,最后制备单克隆抗体并对其鉴定。结果显示,获得的重组蛋白His-VP2分子量约为50 kDa,浓度为8 mg/mL;通过两次亚克隆获得3株杂交瘤细胞株1G10F12、3E3E9、4D12G12,且重链均为IgG1型,轻链均为κ型;其中1G10F12、3E3E9可与重组蛋白Myc-VP2产生Western blot和IFA反应,而4D12G12只能与其产生IFA反应。本研究为IBD诊断方法的建立奠定了基础,同时为深入研究VP2蛋白的功能提供生物学工具。

贵州省2017年~2023年PEDV和PoRVA流行病学调查及PoRVA VP7、VP4基因的遗传演化分析

为了解贵州省猪流行性腹泻病毒(PEDV)和猪A群轮状病毒(PoRVA)的流行情况,本研究对2017年~2023年来自贵州省9个地区139个猪场的165份仔猪粪便样品进行Taq Man RT-qPCR检测,并对PoRVA阳性样品VP7、VP4基因进行RT-PCR扩增、测序,遗传进化分析及其编码氨基酸序列的变异分析。结果显示,PEDV、PoRVA和PEDV+PoRVA的感染率分别为67.88%(112/165)、38.79%(64/165)和21.21%(35/165),且在不同年份、不同地区和不同季节均检出三者的感染。PCR结果显示,本实验扩增出27株PoRVA VP7基因和22株VP4基因;遗传进化分析结果显示共鉴定出6种G型和3种P型,其中G9(29.63%)和P[13](68.18%)为优势基因型,G3、G4、G5、G11、G26、P[6]和P[23]分别占7.41%、22.22%、22.22%、3.70%、14.81%、13.64%、18.18%。21份PoRVA样品鉴定出10种G/P组合基因型,G9P[13](19.05%)为优势组合基因型,G4P[13]、G5P[13]、G3P[13]、G4P[6]、G5P[23]、G9P[23]、G11P[13]、G26P[6]、G26P[13]分别占14.29%、14.29%、9.52%、9.52%、9.52%、9.52%、4.76%、4.76%及4.76%。同源性分析结果显示,27株VP7基因和22株VP4基因序列与NX疫苗株相应基因序列之间的同源性分别为75.5%~94.0%和68.5%~75.6%,氨基酸序列的同源性分别为78.3%~96.6%和72.0%~82.5%,部分PoRVA上述基因序列与国外、人源RVA的同源性最高。氨基酸位点变异分析结果显示,与NX疫苗株相比,所测PoRVA VP7和VP4氨基酸序列均存在特征性位点的变异,其中G型PoRVA VP7无氨基酸位点的缺失和插入,G9型PoRVA VP7存在3处(I^(208)T、K^(212)A/V/T、V^(271)I)变异,G3、G4、G5、G11和G26型PoRVA VP7存在17处(S^(28)R/K、A^(29)I/T/M/V、L^(40)I/V、V^(44)L、S^(71)T、Q^(73)G/N/S/E、S^(90)A/Q/K/R、G^(94)N/S/A/K、N^(100)D/E、T^(122)A/S、T^(147)A/G/N/D、Q^(189)S/T、I^(208)L/Q/T、K^(212)T/I/P/N、A^(213)N/T/D、E^(267)D/N、V^(271)I)变异;3株P[6]型PoRVA VP4在aa136缺失T,13株P[13]型PoRVA VP4在aa188~aa189插入E/D~Y/F,P[6]、P[13]和P[23]型PoRVA VP4存在26处(I^(92)V、Q^(94)E、Q^(113)T/P/N、T^(114)N/Q/S/R、T^(115)Q/E、N^(116)S/L/T、P^(148)A/Q/V/S/I、T^(180)E/N/D、P^(162)T、I^(174)V/L、C^(269)Y、R^(281)N、A^(286)L/S、T^(302)N、A^(340)S/V、T^(379)S、T^(403)A、S^(438)P、R^(553)K、A^(569)A、M^(570)L、A^(608)S、E^(660)D、I^(726)F、K^(733)N、S^(739)T)变异。上述结果表明,2017年~2023年贵州省PEDV和PoRVA感染率高且基因型复杂,其中PoRVA存在以G9型、P[13]型为主的流行,优势组合基因型为G9P[13]。本研究丰富了贵州省PEDV和PoRVA的流行病学资料,尤其为PoRVA感染的防控和候选疫苗株的筛选提供了参考数据。

犬细小病毒CPV-2c型亚洲株分离鉴定及VP2基因序列分析

为探明北京某犬场犬的死亡原因,从患有肠道出血的犬肛拭子中分离出1株犬细小病毒,试验通过PCR、血凝和间接免疫荧光试验方法对毒株进行鉴定,并对VP2基因进行克隆测序和序列分析,确定其遗传分支。结果表明,该分离株属于犬细小病毒CPV-2c型,命名为CPV-BJ21株。应用犬细小病毒单克隆抗体进行间接免疫荧光检测,结果为阳性;基因序列分析表明,分离株与犬细小病毒为同一进化分支,VP2基因核苷酸序列与中国四川的CPV-2c(MH476581.1)同源性达99%,与亚洲分离的犬细小病毒之间亲缘关系较近。VP2氨基酸序列在第A5G、S297A、D426E位出现了氨基酸突变;在F81细胞上传3代后,病毒液的血凝效价稳定于210。本研究可为犬细小病毒的流行情况及新疫苗的研究提供参考依据。

NR2A特异性拮抗剂NVP-AAM077对大鼠海马空间学习和记忆能力的影响

目的基于经典水迷宫空间记忆行为范式,观察大鼠学习记忆前后N-甲基-D-天冬氨酸受体(N-methyl-D-aspartic acid receptor,NMDAR)2A亚单位(NR2A)变化,通过海马齿状回微量注射NVP-AAM077(NR2A拮抗剂)探讨其神经药理学作用及可能机制。方法3月龄♂SD大鼠随机分为行为学训练(Training)和未训练(Non-training)两大组,再分别分为对照和齿状回注射NVP-AAM077(NVP)组。Western blot检测齿状回的NR2A、p-eIF2α、ATF4和脑源性神经营养因子(brain-derived neurotrophic factor,BDNF)表达;向NVP组大鼠齿状回注射整合应激反应抑制剂ISRIB,观察齿状回的p-eIF2α水平、ATF4表达及空间记忆能力。结果与Non-training比较,行为学训练促进大鼠齿状回的NR2A和BDNF表达;Training-NVP大鼠齿状回的NR2A和BDNF表达明显减少,p-eIF2α和ATF4表达增加;ISRIB明显抑制ATF4表达,并翻转注射NVP引起的大鼠空间记忆损伤。结论齿状回注射NVP抑制NR2A通路激活并损害大鼠空间记忆,这种作用主要与海马整合应激反应有关。

猪细小病毒7型VP2蛋白的原核表达及其多克隆抗体的制备

为了表达猪细小病毒7型(PPV7)VP2蛋白(由Cap基因编码)并制备其多克隆抗体,试验从GenBank数据库中下载PPV7 Cap基因序列,选择不同毒株的高频序列作为目的基因序列,使用T4 DNA连接酶将目的基因与pET-32a表达载体连接,将连接产物转化至DH5α感受态细胞中,并使用IPTG对重组菌进行诱导,对表达的重组蛋白进行可溶性分析与纯化并通过Western-blot检测重组蛋白的反应原性,用纯化后的重组蛋白免疫新西兰大白兔制备多克隆抗体并分别通过间接ELISA方法、Western-blot检测多克隆抗体的效价及其与重组蛋白的反应性。结果表明:诱导后的重组菌在56 ku处出现明显条带,重组蛋白主要以包涵体的形式表达;纯化后的重组蛋白为单一条带,质量浓度为0.46 mg/mL,能与His标签抗体特异性结合;制备的多克隆抗体的效价为1∶51200,能与重组蛋白特异性结合。说明PPV7 VP2蛋白获得了成功表达,该蛋白具有良好的反应原性和免疫原性,所制备的多克隆抗体效价较高。

绵羊VPS26A基因克隆、生物信息学及表达谱分析

为获得绵羊液泡蛋白分选26A(Vacuolar Protein Sorting 26A,VPS26A)基因CDS序列,确定其生物学功能,明确其在不同品种不同组织的表达差异,以新吉细毛羊和小尾寒羊为试验动物,以小尾寒羊皮肤组织cDNA为模板通过TA(T's and A's Method)克隆获得CDS区序列,并对序列进行生物信息学分析,预测其可能编码的蛋白质结构和功能;利用实时荧光定量PCR检测VPS26A基因在小尾寒羊和新吉细毛羊不同组织的表达差异。结果显示:VPS26A基因CDS序列全长为981 bp,编码327个氨基酸。绵羊VPS26A氨基酸序列与羚羊相似性最高,同源性为100%,与人的相似性最低,为99.4%;系统进化树结果显示,绵羊VPS26A与山羊和羚羊亲缘关系最近,与人和驴亲缘关系最远。VPS26A蛋白无跨膜结构域和信号肽,存在27个磷酸化位点和2个N-糖基化位点,主要分布在细胞质和核内体上。VPS26A蛋白二级结构预测结果显示,无规则卷曲、延伸链、α螺旋和β转角分别占45.87%、30.28%、18.35%和5.50%,与三级结构预测一致。实时荧光定量PCR结果显示,VPS26A基因在小尾寒羊肺脏中表达量最高,其次是皮肤,而在新吉细毛羊皮肤的表达量均最高,均显著高于其他组织。本研究为进一步阐述VPS26A基因功能奠定了基础。