侵染萝卜的油菜花叶病毒广东分离物分子特征及其致病性分析

【目的】病毒病是萝卜(Raphanus sativus)生产上的主要病害之一,严重危害萝卜生产安全及产业发展。本研究旨在鉴定侵染广东萝卜的病毒种类,探究侵染萝卜的油菜花叶病毒(youcai mosaic virus,YoMV)分子特征及致病性,为萝卜病毒病的防控提供科学依据。【方法】从广东省惠州市萝卜种植基地采集了3个疑似病毒病侵染的萝卜病样及1个无症状样品,提取样品总RNA,利用小RNA深度测序初步探明病毒种类,然后根据测序结果设计病毒特异引物进行RT-PCR验证。应用分段克隆方法扩增病原病毒YoMV基因组1—3405 nt片段和3194—6304 nt片段,然后通过同源重组克隆到pCB301双元载体上,得到YoMV-GD分离物基因组全长序列,同时构建该病毒分离物的侵染性克隆。利用MEGA7软件对YoMV-GD及其他分离物全长核苷酸序列进行系统进化分析。通过侵染性克隆人工注射接种本生烟和普通烟,检验pCB301-YoMV-GD的侵染性,然后再注射接种萝卜和菜心,测定YoMV-GD分离物的致病性。【结果】侵染广东萝卜的病毒包含萝卜隐状病毒3(Raphanus sativus cryptic virus 3,RsCV3)、萝卜黄病毒1(Raphanus sativus chrysovirus 1,RasCV1)、芜菁花叶病毒(turnip mosaic virus,TuMV)、YoMV 4种;YoMV-GD分离物全长序列为6304 nt,编码4个蛋白,分别为124.7 kD复制相关蛋白、183 kD复制酶、30 kD运动蛋白MP、17.7 kD外壳蛋白CP,与YoMV英国分离物(GenBank登录号:AY318866)核苷酸相似性最高,为99.18%;YoMV-GD分离物与英国、德国及我国上海、重庆分离物的亲缘关系较近;构建的侵染性克隆pCB301-YoMV-GD可以系统侵染本生烟和普通烟,引起严重的坏死、枯斑等症状,具有较强的侵染性;YoMV-GD可以系统侵染萝卜和菜心,引起轻微的黄化和花叶等症状,致病力较弱。【结论】侵染广东萝卜的病毒包含RsCV3、RasCV1、TuMV和YoMV,且以复合侵染形式存在;YoMV遗传进化并没有明显的地域性;YoMV-GD对烟草致病力较强,而对萝卜和菜心致病力较弱。

油菜BnSGS3基因克隆及转基因拟南芥病毒抗性

为阐明甘蓝型油菜BnSGS3抗病毒功能,用5′-RACE和巢氏PCR方法从油菜中克隆了BnSGS3。该基因全长2638bp,包含4个内含子和1个1824bp的完整开放阅读框。序列对比发现,BnSGS3与其他SGS3基因同源性在58.9%～97.5%之间。构建BnSGS3过表达载体（BnSGS3-Ov）和干扰表达载体（BnSGS3-Si）,通过浸花（Floral-dip）法转化拟南芥,经除草剂筛选及PCR检测,获得2种转基因拟南芥各30株。拟南芥接种黄瓜花叶病毒（CMV）的抗性鉴定显示,转BnSGS3-Ov植株发病轻,株型基本正常,后期能正常开花结籽,对CMV表现中抗;而转BnSGS3-Si植株发病重,不能正常开花结籽。接种油菜花叶病毒（YoMV）后,2种转基因和非转基因拟南芥均对YoMV表现感病,说明BnSGS3对CMV有一定抗性,但对YoMV无明显抗性。

油菜花叶病毒RT-LAMP快速检测方法的建立

油菜花叶病毒(youcai mosaic virus,YoMV)是侵染地黄和山药的重要病毒之一,能导致中药材的产量下降及品质降低。本研究基于逆转录环介导恒温扩增技术(reverse transcription loop-mediated isothermal amplification,RT-LAMP),建立了针对YoMV的快速、特异、灵敏的RT-LAMP检测方法。根据YoMV外壳蛋白(coatprotein,CP)的核苷酸序列设计了5条特异性引物,建立的RT-LAMP方法最适检测温度为60℃,反应时间为60min,该方法能特异性检测到YoMV,灵敏度是常规PCR的1000倍,可检测9.18×10^(2)拷贝·μL^(-1)模板,本研究建立的RT-LAMP检测技术为地黄和山药上YoMV的准确鉴定提供了快速、高效的方法。

油菜花叶病毒山西地黄分离物的全基因组序列测定与分析

采用双链RNA（double-stranded RNA,dsRNA）技术和非序列依赖PCR扩增（sequence-independent amplification,SIA）方法对感病地黄进行分子鉴定,并测定油菜花叶病毒（Youcai mosaic virus,YoMV）山西地黄分离物（YoMV-SX）的基因组全序列。序列测定及分析发现侵染地黄的病毒为油菜花叶病毒（Youcai mosaic virus,YoMV）。获得YoMV-SX（Gen Bank登录号JX422022）全长为6 304 nt,5＇UTR长度为68 nt,3＇UTR长度为236 nt,含有4个开放阅读框（open reading frame,ORF）。全序列核苷酸一致性分析显示Yo M V-SX与Tobamovirus亚组Ⅲ中分离物的一致性为90.7%-96.0%,与同属亚组Ⅰ和Ⅱ的一致性仅为50.2%-63.3%。全序列系统进化分析表明,YoMV-SX与YoMV-Wh形成一个独立分支,亲缘关系最近。这是YoMV侵染地黄的首次报道。