斑马鱼体细胞核移植—头肾细胞和尾鳍细胞核移入成熟具核卵子发育能力的初步研究

将经直接消化的斑马鱼头肾细胞或经短暂培养的尾鳍细胞核移植到同种成熟具核卵子中 ,移核卵可发育到原肠晚期 ;将移核卵发育成的囊胚细胞核作供体进行第 2次核移植 ,受体卵可发育到尾芽期或肌肉感应期。流式细胞仪测定 DNA含量表明 ,受体卵发育形成的囊胚细胞 DNA含量与正常囊胚细胞 DNA含量相同 ,由此可知 ,移核卵中的雌原核没有参与移核胚胎的发育。

斑马鱼在再生医学研究中的应用及进展

组织器官的再生现象一直以来吸引着众多生物学家们的关注。再生能力在不同物种间差异很大,与人及高等脊椎动物相比,低等脊椎动物(如:斑马鱼)有着较高的再生能力。斑马鱼的鳍、心脏、视网膜、视神经、脊髓、肝脏及感觉毛细胞等都具有很强的再生能力。因此,从斑马鱼再生过程的研究中将获得大量有用的信息,促进对人类再生能力缺陷的认识,进而推动再生医学的发展。文章就斑马鱼在心脏、神经系统、肝脏、鳍再生医学研究中的进展及应用做一综述。

红斑马鱼体色观察及敲除mitfa基因对其体色发育的影响

斑马鱼(Danio rerio)是一种常见的模式生物,红斑马鱼为小型观赏性鱼类之一。鱼类体色主要是由皮肤或鳞片上的色素细胞的种类和分布决定的。黑色素细胞诱导转录因子(MITF)主要调控动物黑色素细胞发育和分化。本文观察了红斑马鱼成鱼的背鳍、臀鳍、腹鳍、胸鳍色素细胞的组成和分布,跟踪观察了红斑马鱼早期体色发育过程。通过CRISPR/Cas9基因敲除技术构建了mitfa基因敲除体系,研究了mitfa基因在红斑马鱼早期体色发育中的作用。结果表明:1)红斑马鱼鳍上分布有红色素细胞、黄色素细胞和少量的虹彩细胞,但背鳍有大量的黑色素细胞;2)在红斑马鱼早期体色发育过程中,首先出现黑色素细胞,接着出现黄色素细胞,一个月后,红斑马鱼的黑色素细胞消退,鱼体表变浅红,变色中体表颜色逐渐加深,最后呈红色、银白色条纹相间分布的成鱼体色;3)利用CRISPR/Cas9技术,敲除mitfa基因,结果发现,mitfa的缺失导致早期红斑马鱼黑色素细胞显著减少。上述研究结果将为观赏鱼的选育以及建立人工改良鱼类体色有效途径提供重要的理论支撑。

生长激素促进斑马鱼尾鳍的再生

目的建立生长激素过表达的转基因斑马鱼,研究生长激素在斑马鱼尾鳍再生过程中的作用。方法利用Gateway技术构建表达质粒"pDestTol2CG2; ubi:GH-polyA",在一细胞期显微注射表达质粒和转座酶mRNA后,通过荧光显微镜和qPCR技术筛选鉴定GH过表达的转基因斑马鱼。将斑马鱼分为对照组(野生型)和生长激素过表达组,尾鳍横切后,记录分析斑马鱼尾鳍再生过程。结果转基因斑马鱼中心脏被绿色荧光蛋白标记。荧光定量PCR检测结果显示GH表达水平显著高于对照组(P<0.05)。斑马鱼尾鳍横断后,生长激素过表达组的再生速度显著提高(P<0.05)。结论建立稳定生长激素过表达的转基因斑马鱼品系,过表达生长激素能够提高斑马鱼尾鳍再生速度。

斑马鱼鳍和鳞片色素细胞的显微观察

目的观察斑马鱼鳍和鳞片色素细胞的组成、分布及形态特征。方法应用光学显微镜对AB品系斑马鱼鳍和鳞片色素细胞的显微结构进行观察。结果斑马鱼鳍上分布有黑色素细胞和黄色素细胞,未观察到虹彩细胞。根据色素细胞的分布规律,将斑马鱼鳍分为有、无斑马鱼条纹两类。鳞片中分布有黑色素细胞、黄色素细胞和虹彩细胞。黑色素细胞较大,形态上主要分为呈树突状、颜色较浅、体积较大的I类黑色素细胞和呈团状、颜色较深、个体较小的Ⅱ类黑色素细胞。黄色素细胞个体最小,呈黄色或者橙黄色。虹彩细胞较长呈长棒状或梭形,数量最少。结论斑马鱼体表有黑色素细胞、黄色素细胞和虹彩细胞三种类型色素细胞,但鳍和鳞片在色素细胞组成和分布上存在着差异,鳞片中色素细胞的种类和形态特征较鳍中色素细胞更丰富。

番红花花提取物对紫外线损伤斑马鱼鱼鳍的保护作用

以斑马鱼为模型,研究番红花花提取物对紫外线诱导斑马鱼鱼鳍损伤的保护作用。将受精后72 h的斑马鱼幼鱼经番红花花提取物溶液处理,同时进行UVB照射后,观察斑马鱼鱼鳍的损伤程度,以及通过吖啶橙染色检测斑马鱼鱼鳍的凋亡细胞。由实验结果可知,在UVB照射后的第1天和第2天,与未照射阴性对照组(-UVB)相比,模型对照组(+UVB)的斑马鱼鱼鳍都出现明显的损伤,而200 mg/L番红花花提取物处理组(+UVB)的斑马鱼鱼鳍有较少的损伤,而且400 mg/L和800mg/L番红花花提取物处理组(+UVB)的斑马鱼鱼鳍几乎没有损伤,与阴性对照组相似;吖啶橙染色结果显示,模型对照组(+UVB)的斑马鱼鱼鳍有大量的凋亡细胞,而实验组(番红花花提取物+UVB)的斑马鱼鱼鳍仅有少量的凋亡细胞,与阴性对照组(-UVB)相似;番红花花提取物对紫外线诱导斑马鱼鱼鳍损伤具有保护作用。

大麻叶提取物的晒后修复功效

通过观察以大麻叶提取物作用后,紫外线(波长305 nm)辐射诱导斑马鱼胚体鱼鳍受损伤程度及尾鳍生长面积所受到的影响,研究大麻叶提取物的晒后修复功效。实验结果表明,在质量浓度0.5和1.0μg/mL大麻叶提取物作用下,相对于模型组,斑马鱼胚体的尾鳍面积随时间延长而增加,表明大麻叶提取物应用于化妆品中具有潜在的晒后修复功效。

自噬对斑马鱼尾鳍再生的影响

目的:利用模式动物斑马鱼研究自噬对其尾鳍再生的影响。方法:选取成年斑马鱼剪去尾鳍,随后腹腔注射自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤(3-Methyladenine,3-MA)或诱导剂STF-62247,连续注射2天,剪取再生尾鳍,通过qPCR分析自噬相关基因ATG和Beclin-1的表达。斑马鱼剪去尾鳍,连续7天腹腔注射3-MA或STF-62247,每天记录斑马鱼尾鳍再生长度。结果:尾鳍再生过程中,3-MA下调ATG和Beclin-1表达,STF-62247提高ATG表达,抑制自噬或诱导自噬对斑马鱼尾鳍再生速度无显著影响。结论:腹腔注射自噬抑制剂3-MA或自噬诱导剂STF-62247对斑马鱼尾鳍再生速度无显著影响。

eomesa^(fh105)斑马鱼无背鳍表型分析及其机制的初步研究

从进化角度来看,鱼类的偶鳍与四足动物的四肢属于同源器官,它们的发育调控机理研究比较清楚;而鱼类的奇鳍是偶鳍的祖先,其发育调控模式与偶鳍相似,但是对奇鳍形成和发育机制的详细研究却很少。本研究对野生型和背鳍缺失突变体eomesa^(fh105)斑马鱼(Danio rerio)背鳍的发育过程进行了比较研究,利用阿尔新兰-茜素红双染色法对野生型和突变体的背鳍骨骼形态进行分析,通过原位杂交和组织qPCR技术对eomesa基因的表达位置和模式进行了分析,最后对野生型和突变体背鳍发育3个标准体长(SL)点的转录组进行了比较研究。背鳍发育观察显示,野生型斑马鱼SL约为6.3 mm时背鳍鳍芽形成,SL约为7.5 mm时,背鳍已经基本形成;而突变体不能形成正常的鳍芽,同时鳍芽的向外生长受到影响,导致无背鳍表型。骨骼染色显示,突变体背鳍骨骼出现3种不同程度的缺陷。组织qPCR和原位杂交显示,eomesa在脑部表达,在背鳍中并无明显表达。转录组分析结果显示,3个标准体长点共有的差异基因很少,其中上调基因19个,下调基因5个。本研究表明,eomesa并不是鳍芽起始的关键基因,但影响了鳍芽的形成或向外生长,最终导致突变体出现多种类型背鳍缺失。

黄精多糖与积雪草苷对糖尿病斑马鱼尾鳍再生的药效学研究

目的 通过建立和使用斑马鱼2型糖尿病模型,探讨黄精多糖与积雪草苷对2型糖尿病斑马鱼尾鳍再生的促进作用。方法 首先对药物进行毒性分析,得出最佳给药浓度范围;通过显微注射链脲佐菌素方法构建斑马鱼2型糖尿病模型,切断斑马鱼尾鳍,经不同给药浓度干预后,测定斑马鱼空腹血糖水平并观察尾鳍再生情况;通过实时定量PCR(qRT-PCR)检测黄精多糖、积雪草苷及联合用药对斑马鱼尾鳍再生相关基因mRNA的表达水平。结果 各给药组均可有效降低斑马鱼空腹血糖水平,且能上调骨再生相关基因的表达,其中积雪草苷高浓度组对成纤维细胞生长因子的表达上调具有显著差异(P<0.01)。结论 黄精多糖、积雪草苷及其联合给药的高浓度组可有效降低斑马鱼空腹血糖水平且具有促进尾鳍再生的效果,为治疗2型糖尿病和促进组织修复方面药物的开发提供理论依据。