玉米醇溶蛋白γ-zein基因载体构建及亚细胞定位

用PCR方法从pROK.TG1LK扩增得到γ-zein基因的全长,克隆到中间载体pMD18-T,获得了重组质粒pMD18-γ-zein,分别用NcoⅠ和BglⅡ2种限制性内切酶酶切重组质粒和经过改良的pCAMBIAI1302载体,经回收、连接、转化、鉴定后,构建了由35S驱动的绿色荧光蛋白(GFP)融合的植物表达载体pCB-GFP-γ-zein,用基因枪法将GFP-γ-zein基因整合到洋葱表皮细胞中,通过共聚焦显微镜观察,该融合基因在洋葱表皮细胞的细胞壁、细胞核和细胞质中得到了表达。

农杆菌介导含硫氨基酸γ-zein转化菊苣的初步研究

含硫氨基酸具有动物营养与免疫相关的重要生理功能,为提高菊苣中含硫氨基酸含量,采用根癌农杆菌介导法将玉米种子贮藏蛋白含硫氨基酸基因γ-zein和绿色荧光蛋白GFP融合基因转入到菊苣无菌苗叶片中,经过共培养、潮霉素抗性筛选、分化、再生和炼苗,得到抗性植株。对抗性植株进行PCR、PCR-Southern、斑点杂交和RTPCR分析,结果表明,外源目的基因已经整合到菊苣基因组中并且得到了表达,为提高菊苣含硫氨基酸含量,改善其品质奠定了基础。

根癌农杆菌介导的甘薯遗传转化及转基因植株的再生

以甘薯优良品种“新大紫”的茎尖培养再生植株为试材 ,经根癌农杆菌介导将甘薯块根贮藏蛋白启动子 (Sporamin promoter)调控下的 10 k D玉米醇溶蛋白基因导入到“新大紫”中 ,并获得了转化植株。甘薯品种“新大紫”再生植株的茎切段 ,与携带有表达载体质粒 p SP10 Z的根癌农杆菌菌株 LBA4 4 0 4共培养后 ,在含 75 mg/ L 卡那霉素 (Kan)的筛选培养基上可产生抗性芽 ,最高频率达 6.2 %。其中 ,32 .1%的抗性芽可在含 10 0 mg/ L Kan的培养基上生根 ,从而形成转化植株。PCR和 PCR-Southern检测证实 ,10 k D玉米醇溶蛋白基因已导入并整合到甘薯品种“新大紫”的基因组中。

玉米19kD醇溶贮藏蛋白基因启动子种子特异性表达控制区段的分析

为研究玉米（Ｚｅａｍａｙｓ Ｌ．）１９ｋＤ醇溶贮藏蛋白（ｚｅｉｎ）基因启动子种子特异性表达的控制区段，将全长６９４ｂｐ的启动子进行５’端缺失，共得到６个缺失突变体，长度分别为４８８ｂｐ、３７８ｂｐ、３０２ｂｐ、１５２ｂｐ、１２４ｂｐ和８５ｂｐ。将６个片段分别与报告基因ｇｕｓ连接构建成表达载体ｐＤＧＢ系列，经土壤农杆菌（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）介导转化，引入烟草。ＧＵＳ活性检测证明，４８８ｂｐ启动子片段能促使ｇｕｓ基因在种子中特异表达。３７８ｂｐ、３０２ｂｐ、１５２ｂｐ和１２４ｂｐ片段启动子引导的ｇｕｓ基因在烟草根、叶柄、种子中均可表达。

10kD玉米醇溶蛋白基因的克隆与植物表达载体构建

由于紫花苜蓿中的含硫氨基酸水平很低,采用基因工程手段将富硫蛋白基因-10kD玉米醇溶蛋白(zein)基因转入苜蓿中以提高其水平。根据该基因的保守序列设计引物,并在下游引物终止密码子前引入内质网驻留蛋白信号序列(KDEL),通过PCR技术从玉米(Zea mays L.)黄化幼苗基因组中扩增目的基因的开放阅读框(ORF)。序列测序得到全长为465bp的目的片断,该片段编码154个氨基酸,其中甲硫氨酸(M)31个占20.13%,半胱氨酸(C)6个占3.90%,含硫氨基酸共占24.03%。该基因与报道的10kD玉米醇溶蛋基因具有很高的同源性。将该基因构建到植物表达载体pCAMBIA13011上,以转化紫花苜蓿提高其含硫氨基酸的水平。

玉米贮存蛋白及高蛋氨酸相关基因研究进展

成熟的玉米籽粒中蛋白质含量为8%～10%,其中,约80%为胚乳蛋白,主要由被称为醇溶蛋白(zein)的胚乳贮存蛋白所构成。玉米醇溶蛋白分为α,β,γ和δ等4种类型,其中,α类型包含19kDa和22kDaα-醇溶蛋白2个组分,β类型只有15kDaβ-醇溶蛋白1种,γ类型包含16kDa、27kDa和50kDaγ-醇溶蛋白等3个组分,而δ类型包含10kDa和18kDaδ-醇溶蛋白等2个组分。在玉米醇溶蛋白中,α类型占70%以上,但其蛋氨酸含量非常低,只有1%～2%。约占20%的β类型,其蛋氨酸含量约10%。γ类型和δ类型的醇溶蛋白在胚乳中的含量很少,但这两类醇溶蛋白的蛋氨酸含量很高,最高分别达到21%和37%。不同的醇溶蛋白由分属于不同多基因家族的基因所编码,涉及到65～100个基因,这些基因存在于不同的染色体上;其中10kDaδ-醇溶蛋白的结构基因dzs10已在高蛋氨酸转基因育种中得到应用。

玉米醇溶贮藏蛋白基因启动子PCR扩增及其驱动GUS基因在转基因烟草种子中的表达

以玉米(Zea mays L.)黄化苗为材料,利用PCR技木扩增了玉米19kDa醇溶贮藏蛋白基因(zein)起始密码子上游启动子片段,序列分析结果表明,克隆的—1～—694片段具有19kDa Zein启动子特点,与同一家族中其它基因的对应区段同源性达90％以上。将此启动子插入pPKGT的GUS基因及NOS终止子上游构成表达载体。经农杆菌转化烟草(Nicotiana tabaccum Var.samsum),得到了转化植株。转化的烟草的PCR扩增及Southern杂交证明目的片段已整合到烟草基因组中。转基因植株的GUS活性检测表明,在叶、根中无GUS活性,GUS活性只存在于种子中。转基因植株烟草种子经冷冻切片,GUS底物X-Gluc活体组织染色证明GUS活性只存在一层介于种子胚乳与种皮之间的细胞中。

玉米醇溶蛋白基因Z_(15)转化石刁柏的研究

利用含有玉米醇溶蛋白基因(Z_(15))的重组Ti质粒感染石刁柏茎段,诱导其产生愈伤组织,并使愈伤组织在MS+0.5 mg/1 NAA+1.5 mg/1 KT的分化培养基上产生不定芽和再生植株,不定芽的诱导率提高了76.7％。经纸电泳测定和卡那霉素抗性鉴定证明,石刁柏的再生植株能够合成胭脂碱,并能在附加200 mg/1卡那霉素的上述培养基上正常生长。

Increase of sulphur-containing amino acids in transgenic potato with 10 ku zein gene from maize

The 10 ku zein gene of maize was under control of patatin class I promoter of potato and transferred into potato genome by the leaf-disc method. The expression of 10 ku zein was determined in the tuber of transgenic plants by RT-PCR. Furthermore, the sulphur-containing amino acids in transgenic tuber increase remarkably.

富含蛋氨酸醇溶蛋白在产朊假丝酵母中的表达研究

为构建表达富含蛋氨酸醇溶蛋白的产朊假丝酵母工程菌株,利用基因工程技术,将玉米δ-10kD-醇溶蛋白基因(zein),酵母的GAP启动子(GAP-p)、终止子(GAP-t)拼接合成表达框,以18S rDNA片段为整合介导区,用放线菌酮(CYH)抗性基因作为筛选标记,结合pBR322质粒构建了同源整合表达载体,把zein基因同源重组整合到产朊假丝酵母染色体上,构建表达zein基因的产朊假丝酵母工程菌株。蛋氨酸含量测定结果显示,重组菌株的蛋氨酸表达量比起始菌株提高了17.14%。该产朊假丝酵母工程菌的构建为下一步提高其蛋氨酸产量的研究和应用打下了良好的基础。

郑58/opaque2近等基因系中opaque2基因突变位点分析与高效分子标记开发

opaque2突变体材料是最常用的高赖氨酸玉米供体。对已获得的郑58/o2近等基因系研究表明,胚乳发育不同时期22-kDα-醇溶蛋白的积累均明显低于郑58。荧光定量PCR结果表明,α-醇溶蛋白家族基因Z1A、Z1B、Z1C和Z1D的表达均显著低于郑58。郑58/o2胚乳发育不同时期Opaque2基因均正常表达。测序分析发现,郑58/o2中o2基因ATG后713 bp处缺失10个碱基,ORF预测Opaque2蛋白翻译提前终止。针对突变缺失位点开发基因内分子标记o2-indel-1,利用该标记进行回交转育,结果表明,o2-indel-1与o2突变表型完全连锁,错选率为0。opaque2基因突变位点的解析有助于高效分子标记的开发,有效降低错选率,提高优质蛋白鲜食玉米多基因聚合育种的选择效率。

玉米品质基因聚合对子粒氨基酸组分及醇溶蛋白的影响

以玉米o2、sh2、su1、wx这4个品质基因聚合的单基因、双基因、三基因近等基因系为研究对象,对子粒氨基酸组分与醇溶蛋白SDS-PAGE带谱进行检测分析。结果表明,与郑58相比较,su1、wx、su1wx氨基酸组分变化较小,o2、sh2单基因以及含有o2、sh2的双基因、三基因近等基因系中氨基酸组分变化较大,o2sh2、o2su1、o2sh2su1赖氨酸含量较高。SDS-PAGE显示,o2与sh2、su1聚合导致19 kD和22 kDα-醇溶蛋白合成受到显著抑制。

富含蛋氨酸玉米醇溶蛋白在大肠杆菌中的表达

目的:克隆玉米中富含蛋氨酸的10kD玉米醇溶蛋白,证明植物源目的基因在大肠杆菌中能够表达。方法:从玉米胚乳中克隆高蛋氨酸基因zein,通过PCR扩增zein片段,连接pGEX-4T-1原核表达载体,转入大肠杆菌中,IPTG诱导后,HPLC测定蛋氨酸含量。结果:经PCR扩增出467bp条带,Blast分析同源性99%,经IPTG诱导进行SDS-PAGE检测,发现在36kD处出现一条明显的条带。诱导后菌体总蛋氨酸含量比正常菌体提高了9.6%。结论:证实了植物源10kD玉米醇溶蛋白在大肠杆菌中能够表达。

玉米超高蛋氨酸18kD δ-醇溶蛋白基因dzs18克隆及其原核表达

以玉米自交系吉818和富含蛋氨酸（Met）的BSSS53为材料,克隆编码超高蛋氨酸18k Dδ-醇溶蛋白（18kD δ-zein）的dzs18基因,并进行原核表达。结果表明,BSSS53中分离的目标DNA序列,其ORF内有8个碱基替换突变,第208个碱基C发生缺失,导致移码突变、产生截短的多肽链。从吉818中分离的目标DNA长度为741 bp,含有由648 bp构成的ORF,编码由215个氨基酸组成的超高蛋氨酸吉818-18kD-δ-zein。与参考序列相比,目标DNA序列中存在29个碱基替换突变、15个碱基的片段插入和3个碱基的片段缺失。吉818-18kD-δ-zein中Met残基数占27.9%,是10kDδ-zein的2倍,且比参考蛋白多20%,其中部蛋氨酸高密区（HMQR）内Met残基数占50.0%。玉米dzs18在原核细胞中的表达受菌株的影响,在大肠杆菌BL21（DE3）中不表达,在Rossetta（DE3）中正常表达。ITPG浓度在0.1-1.5 mmol/L范围内对目标蛋白的表达量没有明显影响;在1-5 h范围内,目标蛋白量随诱导时间的延长而增加,超过6 h,增加不明显。玉米dzs18基因在Rossetta（DE3）中表达的目标蛋白以包涵体即不溶性蛋白质颗粒形式存在。