胞质分裂作用因子4过表达慢病毒载体的构建和稳定转染Neuro-2a细胞的建立

目的:构建胞质分裂作用因子4(DOCK4)过表达慢病毒载体,建立DOCK4稳定过表达的Neuro-2a细胞。方法:在美国国家生物信息中心(NCBI)查找DOCK4的序列并设计合成引物,采用聚合酶链式反应(PCR)法扩增获取DOCK4基因序列,通过Bam HⅠ和AgeⅠ限制性内切酶酶切后,将其与酶切后的慢病毒载体GV492进行连接,构建GV492-DOCK4过表达重组质粒,PCR法鉴定筛选出与目的基因片段长度大小相近的阳性克隆。将GV492-对照质粒和GV492-DOCK4过表达重组质粒分别转染至HEK293T细胞中,转染48 h后收集慢病毒进行包装并测定病毒滴度。将Neuro-2a细胞分为GV492-对照组和GV492-DOCK4组,分别采用GV492-对照组慢病毒和GV492-DOCK4过表达慢病毒感染Neuro-2a细胞,慢病毒感染复数(MOI)为100,感染72 h后采用嘌呤霉素(10 mg·L^(-1))筛选出成功感染GV492-对照组慢病毒和GV492-DOCK4过表达慢病毒的Neuro-2a细胞,荧光显微镜观察各组Neuro-2a细胞生长状态及绿色荧光蛋白表达情况;采用实时荧光定量PCR(RT-qPCR)法和Western blotting法检测各组Neuro-2a细胞中DOCK4 mRNA和DOCK4蛋白表达水平。结果:PCR检测,GV492-DOCK4过表达重组质粒的基因片段长度约为691 bp,测序结果显示GV492-DOCK4过表达重组质粒基因序列与设计合成的DOCK4过表达序列一致;GV492-对照组和GV492-DOCK4过表达组慢病毒的滴度分别为2.5×10^(8) TU·mL^(-1)和2.5×10^(8) TU·mL^(-1);荧光显微镜观察,各组Neuro-2a细胞生长状态良好且存在绿色荧光蛋白表达;RT-qPCR法检测,与GV492-对照组比较,GV492-DOCK4组Neuro-2a细胞中DOCK4 mRNA表达水平明显升高(P<0.01);Western blotting法检测,各组细胞在相对分子质量225000附近出现特异性条带,与GV492-对照组比较,GV492-DOCK4组Neuro-2a细胞中DOCK4蛋白表达水平明显升高(P<0.01)。结论:本研究成功构建DOCK4过表达慢病毒载体,建立了稳定过表达DOCK4的Neuro-2a细胞。

SSR分子标记辅助选择转育棉花胞质雄性不育系的回交亲本

将常规育种选择方法和分子标记技术相结合,对用于回交转育棉花胞质雄性不育系的33个早熟陆地棉品系进行筛选。用9个主要性状观察值和260对SSR引物扩增结果均可将33个品系聚为2大类4亚类,这些亚类之间的表型特征差异较明显。从基于分子标记结果划分出的A1、A2、B1、B2亚类中挑选出关键性状综合表现较好的优良品系,并参照主要性状观察值的聚类结果剔除表现型相似的品系,筛选出8个典型代表优良品系,用以进一步回交转育棉花胞质雄性不育系。

外源性线粒体融合素基因-2转染对肝癌细胞体外生物学行为的影响

目的:研究外源性线粒体融合素基因-2(mitofusin-2gene,mfn2)对肝癌细胞株HepG2体外生物学行为的影响。方法:基因重组构建并鉴定mfn2真核表达质粒pEGFPmfn2,用脂质体将质粒转染培养人肝癌细胞株HepG2,经G418筛选阳性细胞克隆,逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测转染后细胞mfn2mRNA的表达水平,Western-blot检测线粒体融合蛋白的表达,四甲基偶氮唑蓝(MTT)法检测mfn2对HepG2细胞增殖的影响,Annexin-V/PI双标流式细胞术检测转染细胞凋亡的变化。结果:重组真核表达质粒pEGFPmfn2经限制性内切酶双酶切,电泳后显示约2300bp的mfn2片段和4700bp的pEGFP-N2载体片段。RT-PCR及Western-blot显示转染pEGFPmfn2组有mfn2基因mRNA及其蛋白表达。MTT实验提示转染mfn2基因后,HepG2细胞增殖受到抑制;流式细胞分析显示转染pEGFPmfn2组与转染pEGFP组和空白对照组相比可促进细胞凋亡。结论:成功构建了pEGFPmfn2真核表达质粒,外源性mfn2基因可抑制肝癌细胞的增殖,并可诱导肝癌细胞凋亡。

阿尔茨海默病转线粒体DNA细胞模型胞质钙稳态的改变

目的观察阿尔茨海默病(Alzheimer's disease,AD)转线粒体DNA细胞模型胞质游离钙水平,探讨线粒体DNA(mitochondrial DNA,mtDNA)缺陷在AD发病中的作用。方法 将正常青年人、正常老年人和AD患者的血小板分别与无mtDNA细胞融合,建立转mtDNA细胞模型。采用微测量法测定细胞色素C氧化酶(cytochrome C oxidase,COX)的活性;用荧光探针Fluo-3标记胞质内游离钙离子,激光共聚焦显微镜和流式细胞仪观察细胞胞质钙离子荧光强度。结果 AD转mtDNA细胞COX活性与正常老年对照相比差异有统计学意义(P<0.05);静息状态胞质钙离子浓度升高,氧化磷酸化解耦联剂CCCP刺激后胞质钙离子的调节能力明显降低。结论 AD患者线粒体存在COX缺陷,使线粒体钙库功能下降,导致细胞内胞质钙稳态失衡。

甘蓝型油菜胞质雄性不育三系的双低转育

以品质双高雄性不育系９３２１９７Ａ为母本，以双低品种（系）８４００１等为父本通过测交、连续回交获得芥酸含量＜１％、硫甙含量＜４０μｍｏｌ／ｇ的双低雄性不育系及其保持系９６Ｆ００１Ａ、Ｂ。用双高恢复系材料９３３００１、９３３０２５与双低品种（系）８８４０８９４等杂交，自交分离选择获得了９５ＳＦ０３５等双低恢复系。研究表明套帐隔离回交较单株成对交可减少回交世代数，缩短双低转育年限，连续２～３代单株分析筛选可提高双低单株成系的品质稳定性。

重组腺病毒介导hCGPx转染致血管内皮细胞产生抗氧化损伤作用的研究

目的研究重组腺病毒介导的人胞浆型谷胱甘肽过氧化物酶(hCGPx)转染对血管内皮细胞ECV304氧化损伤保护作用。方法将含hCGPxcDNA的质粒pGEM-T-hCGPx和重组腺病毒载体pACCMV-pLpA穿梭质粒进行基因重组,构建成pACCMV-hCGPx穿梭质粒后,与包装质粒pJM17共转染293细胞,构建成重组腺病毒AdCMV-hCGPx。用AdCMV-hCGPx转染体外培养的ECV304细胞并分为转染24、48和72h组,以转染空载体的细胞为对照组,检测转染细胞的基因表达水平。各组ECV304细胞经H2O2氧化损伤处理后,分别对细胞的活力和凋亡进行检测分析。结果各转染组细胞转染基因表达率均显著高于对照组(P<0.01)。经H2O2氧化损伤处理后,AdCMV-hCGPx转染组细胞活力较对照组明显增强,凋亡受到抑制。结论重组腺病毒介导的hCGPx转染可保护ECV304细胞抵抗氧化损伤,具有明确的细胞保护作用,其具体保护机制可能与抗氧化和抑制细胞凋亡有关。

磷酸钙转染小鼠生精细胞的方法

为了研究磷酸钙转染小鼠生精细胞,试验以小鼠生精细胞的体外转染为例,简述了磷酸钙法转染细胞的操作方法、步骤及转染效果。结果表明:磷酸钙法转染小鼠生精细胞的转染效率可达75%以上,实现了干扰靶基因的目的。说明磷酸钙法转染哺乳动物细胞效果较好,可以很好地将RNA干扰技术应用到哺乳动物特定基因功能研究及调控等生命科学领域。

《金匮要略》转胞析

系统梳理后世对《金匮要略》转胞证治的不同观点 ,认为“转胞”的“胞”当作广义理解 ;结合现代医学 ,认为临床上许多病症如妊娠合并肾盂积水等皆可从转胞论治 ;进一步从内治、外治等方面对转胞证治进行总结。

半夏泻心汤含药血清对人胃癌腹膜转移细胞增殖的影响

目的:研究半夏泻心汤含药血清对体外人胃癌腹膜高转移潜能细胞株GC9811-P增殖的影响。方法:采用血清药理学方法、MTT法及台盼兰染色法观察半夏泻心汤对GC9811-P细胞的敏感性及生长抑制作用。结果:半夏泻心汤含药血清对GC9811-P较为敏感,对其增殖有明显的抑制作用,且有显著的剂量-效应关系(P<0.05)。结论:半夏泻心汤对GC9811-P细胞的增殖有一定的抑制作用,提示辛开苦降法可能是中医药防治胃癌腹膜转移的主要治法之一。

转胞识

转胞识马德孚新疆中医学院（８３００５４）主题词《金匮要略》中医名词考证高校教材《金匮要略讲义·妇人杂病脉证并治第二十二》篇中第十九条，论述转胞病证中，解释“胞”同脬即膀胱；而“胞系了戾”指膀胱之系缭绕不顺。就此，谈谈粗疏看法，共同切磋，以期斧正。１胞...

人胞质转硫酶的研究进展

硫酸化反应（sulfation reaction）是重要的二相代谢反应,在许多内源性物质（如胆汁酸、激素和神经递质等）生物代谢与外来异物（如治疗性药物、毒性化合物、化学致癌物）的生物活化中起重要作用。通过硫酸化反应,磺酸基从3＇-磷酸腺苷-5＇-磷酸硫酸酯（PAPS）传递至底物的亲核部位。催化硫酸化反应的酶系是转硫酶（sulfotransferase,

转Bt基因荧光假单胞菌工程菌在河北省的环境释放及跟踪监测

转Bt基因荧光假单胞菌工程菌BioP8在河北省保定市进行了环境释放及跟踪监测,对其在田间的定殖、扩散、田间防效、对田间节肢动物群落的影响以及工程菌与土壤中天然芽胞杆菌消长动态关系进行了调查。工程菌BioP8在棉田棉叶和土壤中均能定殖、存活,且消长趋势相近,在施药后第3天BioP8菌密度均达最高值,之后趋于衰减;室内模拟试验研究说明工程菌BioP8与土壤中天然芽胞杆菌之间不存在相互拮抗作用;BioP8对棉田中的天敌有较明显的保护作用,BioP8防治区的益害比最高为3 92∶1,比化防区最高益害比高45 2%。工程菌对田间节肢动物群落物种丰富度有一定的影响,BioP8防治区的节肢动物个体总量介于化防区和空白对照区的个体总量。

光动力治疗促进反义bcr-abl寡核苷酸K562细胞核内转染的实验观察

目的:体外研究光动力治疗(photodynamictherapy,PDT)对b3a2型反义bcr-abl寡核苷酸(assntisenseoligonucleotides,ASO)慢性髓细胞性白血病(chronicmyelogenousleukemia,CML)细胞株K562转染的影响,为PDT合并反义技术应用于CML患者治疗以及体外骨髓净化提供实验基础。方法:半导体激光,波长650nm,剂量9J/cm2垂直照射。光敏剂为血卟啉单甲醚(hematoperphyrinmonomethylether,HMME),采用体外细胞培养技术,荧光显微镜检测荧光标记的反义bcr-abl寡核苷酸在K562细胞中的分布情况。结果:PDT6h后,细胞内荧光物质主要以明亮的点状聚集在胞核和部分胞浆中,而直接转染时,胞内荧光物质则弥散分布于胞浆中。结论:PDT可以使反义bcr-abl寡核苷酸K562细胞转染主要集中于细胞核内。

呼吸道合胞病毒M_(2-1)基因转染人肺腺癌细胞(PAa)后的电镜观察

目的:探讨呼吸道合胞病毒(RSV)M2 1基因致癌的超微形态学依据。方法:应用超薄切片电镜技术对比观察RSVM2 1基因转染前后人肺腺癌细胞(PAa)的超微结构改变。结果:转染后肺腺癌细胞(PAa M2 1)呈现低分化超微结构特征:细胞膜表面微绒毛减少或缺如;细胞核明显增大,核浆比例增大,多见畸形核和双核,并可见巨大或多个核仁。核膜不规则,呈锯齿状或佛手状,核质富含常染色质。癌细胞胞浆少,以游离核糖体为主,其他细胞器稀少。偶见癌细胞凋亡。未转染肺腺癌细胞(PAa)呈现高分化超微结构特征:细胞表面有许多微绒毛;胞浆内有较多发育完好的细胞器。结论:RSVM2 1基因的转染和表达可诱导和促进PAa细胞去分化,其变化的分子机理有待进一步探讨。

脂质体转染绵羊睾丸生精细胞的方法研究

细胞转染技术是将外源DNA、RNA分子导入真核细胞的技术,也是研究细胞基因功能的有效手段之一。本文以绵羊生精细胞的体外转染为例,简述了Lipofectamine~2000转染绵羊生精细胞的方法、步骤和注意事项。结果表明:Lipofectamine~2000转染绵羊生精细胞效率高达80%以上,效果良好,操作简便。说明利用RNA干扰技术在研究哺乳动物基因功能及调控方面,脂质体转染细胞可作为一种有效的技术手段。

恶臭假单胞杆菌转谷氨酰胺酶基因的克隆及原核表达载体的构建

通过PCR方法扩增恶臭假单胞杆菌 (Pseudomonasputida )H76的转谷氨酰胺酶 (transglutaminase ,TGase)基因 ,然后将扩增的约 80 0bp的基因片段克隆到pET_2 8a(+)表达载体上 ,构建重组TGase的表达载体。酶切鉴定阳性的重组质粒命名为pET_TGase。核苷酸及推导的氨基酸序列分析表明 ,该基因与恶臭假单胞杆菌KT2 4 4 0的相应基因有很高的同源性。

苏云金芽胞杆菌高效电转化方法的建立

电转化已经成为苏云金芽胞杆菌工程菌构建过程中非常重要的一种外源基因导入方法.高效率的电转化方法将加速这类研究进展.通过对培养基、培养时间、感受态细胞制备、电转化缓冲液、电压参数的优化,建立一种高效的苏云金杆菌电转化方法.苏云金杆菌生长在含有0.5 mol/L山梨醇的BHI培养基中,30℃振荡培养至OD600值达到0.6～0.8,细菌细胞经1 g/L蛋白酶K在37℃处理20 min,然后用电转化缓冲液洗涤2遍,设定电压为1 800 V,电击1次.利用该方法,pHT315质粒在苏云金杆菌中的转化效率大幅提高.

Noggin-siRNA的胞内转染对间充质干细胞成骨分化的影响

目的探究Noggin-siRNA的胞内转染对间充质干细胞(MSCs)成骨分化的影响。方法利用转染试剂将Noggin-siRNA转导入MSCs中,细胞流式检测转染后MSCs的细胞表型,MTT检测转染后MSCs的增殖活性并绘制细胞生长曲线,碱性磷酸酶(ALP)染色、实时荧光定量PCR(QRT-PCR)、Western Blotting检测转染后的MSCs的成骨分化。结果通过与对照组比较,实验组细胞的细胞表型和生长曲线没有明显改变,ALP染色阳性细胞比率及成骨相关基因与蛋白表达量明显提高。结论 Noggin-siRNA的胞内转染对MSCs成骨分化的促进作用是安全的、可靠的、高效的。

应用聚合酶链式反应快速特异鉴定假单胞菌和伯克霍尔德氏菌(R)-3-羟基酯酰载酯蛋白-辅酶A转酰基酶基因(英文)

聚羟基脂肪酸酯 (PHA)是一类具有广泛应用前景的可降解生物塑料。因其可以以葡萄糖等廉价底物直接发酵生产PHA而日益受到重视。目前的研究表明在积累中长链PHA的假单胞菌中 ,由phaG基因编码的 (R) 3 羟基酯酰载酯蛋白 辅酶A转酰基酶 (PhaG)起关键作用 ,但目前为止对该蛋白还知之甚少。通过聚合酶链式反应 (PCR)建立了一种快速、特异鉴定phaG基因的方法 ,应用该方法成功地从两株积累不同PHA的假单胞菌Pseudomonasstutzeri 1317和Pseudomonasnitroreducens0 80 2中分别克隆得到phaG基因 ,并在phaG基因突变株PseudomonasputidaPHAGN 2 1中表达成功。同时 ,还首次报道了从非假单胞菌菌株BurkholderiacaryophylliAS 1 2 74 1中鉴定得到phaG基因 ,提示PhaG介导的中长链PHA合成途径作为一种通用的代谢模式在细菌中广泛存在 ,为进一步实现从廉价的非相关底物合成中长链PHA提供了必要的分子生物学基础。