冷胁迫下普通油茶CCCH型锌指蛋白基因家族的鉴定和分析

【目的】为挖掘和利用耐寒普通油茶Camellia oleifera遗传资源提供参考。【方法】基于普通油茶的冷胁迫转录组数据,对其CCCH型锌指蛋白基因进行鉴定,并对CCCH型锌指蛋白进行理化性质分析、系统发育分析、保守结构域预测、二级结构预测等相关生物信息学分析,并以庐山高海拔油茶(LSG)和栽培油茶品种赣无1(GW1)为材料,对CCCH型锌指蛋白基因在冷胁迫下的表达情况进行分析。【结果】在普通油茶的冷胁迫转录组数据中共鉴定到24个CCCH型锌指蛋白基因,参考水稻分类方法,将24个CCCH型锌指蛋白聚类到2个亚家族中。保守基序分析结果表明,在24个基因中仅有3种CCCH型锌指蛋白基序类型,即C-X8-C-X5-C-X3-H、C-X7-C-X5-C-X3-H和C-X5-C-X4-C-X3-H,数目分别为92、4和4。转录组表达谱分析结果表明:在野外冷胁迫试验中CoC3H17基因在D4、D5和D6时期的表达量高于D1、D2和D3时期,在室内冷胁迫试验中庐山高海拔油茶和赣无1的CoC3H17基因一直表现为更高的转录本丰度;CoC3H14和CoC3H24基因在野外试验的D4、D5和D6时期均表现为表达量明显上升,且在室内冷胁迫试验中庐山高海拔油茶的这2个基因的表达量高于赣无1。【结论】CoC3H17、CoC3H14和CoC3H24基因可能是普通油茶应对冷胁迫的关键基因。

青花菜锌指蛋白基因BoCCCH1的克隆和表达分析

CCCH锌指蛋白广泛存在于真核生物中,在植物的生长、发育和逆境胁迫响应中起着重要作用。为获知青花菜CCCH转录因子基因的序列特征和表达特性,从青花菜叶片中克隆到1个CCCH基因,命名为Bo CCCH1,同时,利用RT-PCR方法研究了其在不同器官及霜霉菌侵染叶片中的表达模式。序列分析结果表明,Bo CCCH1的基因组全长为1 568 bp,包含1个长度为599 bp的内含子,2个长度分别为627 bp、342 bp的外显子,编码322个氨基酸,蛋白质的分子量与等电点分别为35 296.42 Da和8.47;Bo CCCH1有2个锌指结构,类型均为C-X8-C-X5-C-X3-H。系统发育分析结果表明,Bo CCCH1与其它植物的21条同源序列在进化树上分为6组,来自十字花科的CCCH与Bo CCCH1处于同一分支。基因表达结果表明,Bo CCCH1在叶、花茎、嫩角果、花蕾和花中表达,其中花茎和嫩角果的表达量最高,但在根中未检测到表达;在霜霉菌侵染下,叶片Bo CCCH1的表达量升高,到24 h和36 h时达到最大,推测Bo CCCH1与霜霉病抗性相关。本研究为进一步探明Bo CCCH1在霜霉病抗性反应中的功能奠定了基础。

刚毛柽柳ThZFP3基因的耐盐抗旱功能

【目的】锌指蛋白(ZFP,Zinc Finger Proteins)是植物中的一类重要的转录调控因子,在植物生长发育、逆境胁迫应答等方面具有重要的作用。通过分析刚毛柽柳Tamarix hispida锌指蛋白基因ThZFP3的耐盐、抗旱功能,为林木抗逆遗传改良提供了理论基础。【方法】在通过蘸花法获得过表达ThZFP3转基因拟南芥;在NaCl和Mannitol(甘露醇)胁迫下,观察转基因和对照拟南芥的萌芽成活率、根长、鲜质量和表型变化;在利用农杆菌瞬时转化体系获得瞬时过表达(OE)、抑制表达(RNAi)和对照(Control)转基因刚毛柽柳,胁迫下分别对三种转基因柽柳进行组织化学染色和抗逆相关生理指标测定,鉴定ThZFP3基因的抗旱、耐盐能力。【结果】在胁迫条件下,转基因拟南芥的萌芽成活率、根长、鲜质量和长势均优于野生型,表明ThZFP3基因可提高转基因拟南芥的抗旱耐盐能力;过表达ThZFP3基因显著增强了刚毛柽柳中POD和SOD的活性,从而减少活性氧(ROS)的积累;过表达ThZFP3基因可以减少刚毛柽柳中MDA的积累、降低电解质渗透率,保护细胞膜的完整。【结论】过表达ThZFP3基因可以提高刚毛柽柳体内ROS清除能力,降低细胞损伤程度,从而提高刚毛柽柳的抗旱耐盐能力。

核盘菌和灰葡萄孢菌CCCH锌指蛋白基因的鉴定和比较分析

CCCH锌指蛋白(zinc finger proteins)广泛分布于动物、植物和微生物之中,在RNA代谢过程中起着重要作用,通过鉴定核盘菌和灰葡萄孢菌Zf基因,为基因克隆、表达分析和功能研究奠定基础。本研究以核盘菌和灰葡萄孢菌全基因组序列为材料,运用生物信息学的手段开展Zf基因的全基因组鉴定和分析。经分析,核盘菌和灰葡萄孢菌各有11个Zf基因,它们的开放性阅读框全长分别为633～3741bp和633～3486bp;共检测到55个CCCH锌指基序,以C-X7-C-X5-C-X3-H(22个)和C-X8-C-X5-C-X3-H(21个)最为常见,其中C-X8-C-X6-C-X3-H和C-X7-C-X6-C-X3-H为2种新发现的基序类型;进化分析结果表明,22个Zf基因聚为4组,除SS1G_13631、SS1G_09360、BC1T_00310和BC1T_05217外,核盘菌和灰葡萄孢菌的Zf基因分别位于不同的小分支,该结果与Zf基因的基因结构、基序数量和分布情况一致。

植物CCCH型锌指蛋白研究进展

锌指蛋白是具有典型锌指结构特征的超蛋白家族,几乎参与了生物体生长发育的各个阶段,其中CCCH型锌指蛋白包含一个或多个由三个半胱氨酸和一个组氨酸组成的基序。本文综述了植物CCCH锌指蛋白的结构、作用方式、功能等方面的研究进展,并对其应用前景进行了展望。

水稻CCCH型锌指蛋白亚家族Ⅰ基因的表达分析

CCCH型锌指蛋白是一类生物体中广泛存在的转录因子,与植物的抗逆性密切相关。水稻CCCH锌指蛋白家族包括67个成员,分为8个亚家族。本研究采用实时定量PCR技术分析水稻CCCH亚家族Ⅰ基因的组织表达模式以及盐、干旱、低温、高温等多种非生物胁迫和脱落酸(ABA)对CCCH基因表达水平的调节。结果表明,多数CCCH基因都不同程度地受到这些非生物胁迫及ABA的诱导或抑制,其中C3H10、C3H24、C3H33、C3H37和C3H67的表达量在不同胁迫处理后表现出不同程度的升高,C3H35、C3H50和C3H52在盐、干旱、ABA、低温和高温处理后表达水平呈下降趋势,表明这些CCCH锌指蛋白可能参与水稻的非生物胁迫响应。

基于数据挖掘分析ZC3H13在透明细胞肾细胞癌中的表达及预后意义

目的分析ZC3H13在透明细胞肾细胞癌(ccRCC)中的表达及预后意义。方法利用Ualcan和GEPIA数据库分析并验证ZC3H13 mRNA在ccRCC中的表达及其与临床病理指标和生存期的关系,对ZC3H13基因进行共表达分析及相关性分析。利用人类蛋白质图谱(HPA)数据库中的细胞系及免疫组化结果分析ZC3H13蛋白在ccRCC中的定位及表达情况。利用STRING在线分析以ZC3H13为中心相关蛋白之间的相互作用。结果Ualcan数据库结果显示,在ccRCC、乳头状肾细胞癌(PRCC)、嫌色细胞肾细胞癌(CRCC)中,ZC3H13 mRNA表达水平均下调(P<0.05)。GEPIA数据库结果显示,相比于正常肾组织,ZC3H13 mRNA在ccRCC、PRCC、CRCC这3种亚型肾细胞癌中表达水平均下调(P<0.05)。Ualcan数据库结果显示:Ⅰ期ccRCC患者ZC3H13 mRNA表达水平高于Ⅲ期者(P<0.05);与ccA型比较,ccB型ccRCC患者的ZC3H13 mRNA表达水平较低(P<0.05);ccRCC患者的组织学分级与ZC3H13 mRNA的表达水平有关,相比于低组织学分级患者,具有高组织学分级的患者ZC3H13 mRNA的表达水平更低(P<0.05)。在GEPIA数据库中,随着ccRCC肿瘤分期的升高,ZC3H13 mRNA的表达量逐渐下降(P<0.05)。Ualcan数据库挖掘性分析发现,在ccRCC中,与ZC3H13 mRNA高表达组比较,ZC3H13 mRNA低表达组生存期较短(P<0.05)。GEPIA验证性分析发现,在ccRCC中,与ZC3H13 mRNA高表达组比较,ZC3H13 mRNA低表达组的总生存期和无瘤生存期下降(P<0.05)。HPA数据库结果显示,在A-431肿瘤细胞系中,ZC3H13主要定位于核膜和肌动蛋白丝。利用免疫组化抗体分析显示,ZC3H13蛋白主要表现为细胞核着色,部分胞质轻微着色。ZC3H13与VHL、PBRM1、mTOR、HIF-1α等ccRCC多种关键基因呈正相关(P<0.05)。STRING在线分析显示,ZC3H13与WTAP、POLR2B、KIAA1429等基因共同参与RNA修饰与代谢、RNA甲基化等生物学过程。结论ZC3H13在ccRCC中低表达,与肿瘤恶性生物学行为和不良预后相关。ZC3H13与VHL、PBRM1、mTOR、HIF-1α等ccRCC发生、发展及预后进程中的重要基因存在一定联系,有望成为评估ccRCC预后和指导治疗的新型分子标志物。

具有CCCH锌指结构域的蛋白质12D在肺腺癌中的表达、预后及免疫特征分析

目的分析具有CCCH锌指结构域的蛋白质12D(ZC3H12D)在肺腺癌中的表达及预后价值,探讨ZC3H12D的表达与肿瘤免疫细胞浸润的关系。方法检索癌症基因组图谱(TCGA)数据库肺腺癌中ZC3H12D的表达情况,探讨临床病理特征与ZC3H12D表达的关系;采用Kaplan-Meier方法和基于总生存期(OS)的单因素、多因素回归分析来评估ZC3H12D在肺腺癌中的预后价值;利用GeneMANIA数据库分析肺腺癌中与ZC3H12D相关的蛋白质互作网络及信号通路;利用TIMER、TISIDB数据库和ssGSEA方法分析ZC3H12D表达与肺腺癌中免疫细胞浸润水平的相关性。结果肺腺癌中ZC3H12D的表达高于临近的正常组织,并与肺腺癌患者的临床病理特征相关,差异有统计学意义(P<0.05),表明高表达多预示预后不良。蛋白质互作网络分析发现,ZC2H12A、ZC2H12B、N4BP1、ZC2H12C、KHNYN、RPGRIP1L、NYNRIN、OR2V2、GPR75、ZNF488、FCER2、ZNF280B、GRAP、P2RX5、SLAMF6、CD80、TCF7、AICDA、PARP15和TUBB1等与ZC3H12D具有相互作用,且主要与免疫细胞信号通路相关。ZC3H12D表达与肿瘤浸润性免疫细胞呈正相关(P<0.05)。结论ZC3H12D是在肺腺癌中高表达的独立预后指标,且能影响免疫细胞浸润水平,或可作为肺腺癌潜在的诊断及预后生物标志物。

CCCH型锌指蛋白在白血病中的研究进展

CCCH型锌指蛋白包含1到6个拷贝的CCCH类型的锌指基序,折叠成特殊的指状结构,通过与富含腺嘌呤和尿苷(AU)的m RNA 3'端结合,参与调节m RNA代谢。作为转录因子,免疫调节因子和肿瘤抑制蛋白,临床上与多种疾病密切相关。研究证实,CCCH型锌指蛋白可通过调节血细胞的增殖、分化、凋亡参与白血病发生发展的进程。靶向干预CCCH型锌指蛋白或基因可能是一种治疗白血病的有效方法,可为白血病的防治提供新的策略。

矮牵牛冷响应锌指蛋白基因PhTZF1的分离与表达分析

利用矮牵牛基因表达谱芯片筛选出应答低温胁迫的关键基因,从中发现1个CCCH型的锌指蛋白基因PhTZF1。通过RT-PCR分离获得该基因的cDNA全长为2 085bp,预测其编码694个氨基酸,含有2个CCCH型锌指蛋白保守结构域。系统进化树分析发现,PhTZF1与拟南芥AtSZF1相似度最高。利用半定量RT-PCR检测其在根、茎、叶和花中的表达特性发现,正常生长条件下该基因在各组织中的表达都较弱;利用实时定量PCR检测其在低温、干旱、ABA、MeJA、高盐和高渗胁迫处理下的表达情况发现,PhTZF1表现出不同程度的上调,其中对低温胁迫最为敏感且上调倍数最高,初步推测该基因与矮牵牛应答低温、干旱等非生物逆境相关。

水稻RNA结合蛋白C3H12与RNA结合位点的鉴定

CCCH型锌指蛋白质C3H12是进化上保守的RNA结合蛋白质,它含有5个串联的CCCH锌指结构域ZnF1-5,形成2个紧密的锌指簇ZnF1-3和ZnF4-5。早期的研究发现,C3H12可能通过与mRNA结合的方式在转录后水平调控基因的表达。然而,与C3H12结合的mRNA类型和他们的结合模式,并未通过实验得到证明。本文表达纯化了一系列C3H12截短及全长蛋白质,并合成了一些潜在RNA底物ARE9、ARE19及对照Random21。通过等温滴定量热法(isothermal titration calorimetry,ITC)确定了C3H12与富含腺嘌呤尿嘧啶单元(AU-rich element,ARE)mRNA底物的结合,并揭示了互作核心区域和热力学性质。通过荧光光谱分析和微型热泳动(microscale thermophoresis,MST)技术对ITC的结果进一步佐证。结果表明:(1)C3H12与ARE底物的相互作用是焓驱动的能量有利的(ΔG<0)特异性结合,结合比为1:1。(2)C3H12与ARE19的亲和力较ARE9更高(约2倍)。(3)C3H12中ZnF1-3在与ARE类底物的结合活性中发挥主导作用。(4)C3H12结构中的141个氨基酸残基的接头不直接参与和ARE底物的相互作用。本研究揭示的CCCH型锌指蛋白质C3H12与ARE底物结合模式,将为进一步在分子结构水平阐明C3H12与ARE底物结合的机制奠定基础。

紫外交联合并串联亲和纯化高效鉴定蛋白复合物组分的RNA结合活性

RNA结合蛋白在RNA的生成与代谢中发挥着重要作用.我们在近年报道的PAR-CLIP(photoactivatableribonucleoside-enhanced crosslinking and immunoprecipitation)技术的基础上建立了一套快速、有效鉴定RNA结合蛋白的实验方法:以串联亲和纯化替代一步免疫沉淀获得高纯度蛋白-RNA复合物;将Sypro Ruby蛋白染色与RNA放射自显影相结合判断复合物中哪种或哪些组分为RNA结合蛋白,该方法命名为紫外交联合并的串联亲和纯化(cross-linkingand tandem affinity purification,CLiTAP).运用该方法对布氏锥虫的三种锌指蛋白ZC3H7、ZC3H34和ZC3H5进行分析,发现ZC3H7作为帽结合蛋白复合物的核心组分具有很强的RNA结合能力;ZC3H34结合RNA能力较弱,但其互作蛋白具有强的RNA结合活性;相比之下,ZC3H5及其复合物组分皆无RNA结合活性.这些结果表明,CLiTAP与蛋白质鉴定方法相结合,能够有效鉴定靶蛋白复合物中的RNA结合蛋白种类,也为进一步定位RNA结合位点、研究RNA结合蛋白的结构及作用机制奠定了基础.

异源表达玉米ZmC3H54基因增强水稻的耐旱性

CCCH锌指蛋白是一类重要的转录调控因子。从玉米中分离得到一个受干旱和ABA诱导表达的CCCH型锌指蛋白基因ZmC3H54,通过构建过量表达载体并转化水稻来进一步研究其功能。与对照组相比,转基因植株在干旱胁迫处理下具有更高的相对含水量与存活率以及较低的相对电导率,表明过量表达ZmC3H54基因可以提高转基因水稻的耐旱性。此外,转基因水稻幼苗对外源ABA敏感性更高。以上结果表明玉米ZmC3H54基因可能是通过ABA信号通路调控植物对干旱的耐受性。

水稻OsCCCH基因家族的组织表达谱及胁迫诱导表达特征研究

CCCH型锌指蛋白是一类生物体中广泛存在的转录因子,在多种植物生物学过程中起着关键的调控作用。在水稻全基因组中已发现67个CCCH基因,分为8个亚家族,而其中大部分基因的功能尚缺少研究。本研究通过荧光定量RT-PCR技术分析了水稻Os CCCH家族基因的组织表达模式以及盐、PEG、低温等非生物胁迫和脱落酸(ABA)对CCCH基因的诱导表达特征。结果表明,大部分Os CCCH基因在各组织中有不同的表达模式,约30%基因为低丰度表达,50%以上基因表现为中丰度表达,极少Os CCCH基因为高丰度表达,包括Os C3H2、Os C3H35、Os C3H41、Os C3H43、Os C3H58和Os C3H67这6个组织优势表达基因。多数Os CCCH基因都不同程度地受到盐、PEG、低温及ABA的诱导或抑制,表明这些CCCH锌指蛋白可能参与水稻的非生物胁迫响应;在四种胁迫下,有7个基因同时受到诱导,其中Os C3H17基因上调倍数高达17倍以上;有10个基因同时被抑制,其中Os C3H16基因下调倍数高达31倍以上。

番茄CCCH型锌指蛋白基因SlC3H64和SlC3H65的特征与表达分析

以番茄品种"中蔬6号"为试材,采用生物信息学方法和实时荧光定量PCR技术,分析研究了番茄SlC3H64和SlC3H65锌指蛋白结构特点,启动子序列内所含胁迫响应元件类别,以及2个基因组织表达模式和非生物胁迫条件下表达量变化差异。结果表明:番茄SlC3H64和SlC3H65的蛋白预测结构差异较大;启动子序列分析发现,2个基因中分别含有11个和7个不同的胁迫响应元件,且二者除了TC-rich repeat元件相同外,其余元件均不同;SlC3H64和SlC3H65在"中蔬6号"根、茎和叶中都有表达,且都在叶中表达量最高,5种不同胁迫处理条件下,SlC3H64响应水杨酸(SA)和高温处理,而SlC3H65则仅响应甘露醇处理。

芝麻CCCH锌指蛋白基因SiC3H1的克隆及表达分析

CCCH锌指蛋白是真核生物中广泛存在的一类转录调节因子,在植物生长发育及逆境胁迫应答中具有重要功能。本研究基于芝麻转录组数据,筛选并克隆到一个芝麻干旱应答相关的CCCH锌指蛋白基因SiC3H1,并对其在不同非生物逆境胁迫下的表达变化进行了研究。测序结果表明,SiC3H1基因编码序列长1 110 bp,编码369个氨基酸。对其编码蛋白进行序列分析发现,该蛋白含有2个CCCH型锌指结构域。进化树分析表明,SiC3H1与番茄和马铃薯中的同源基因相似度较高。启动子序列分析显示,SiC3H1启动子区域含有参与防御和胁迫应答的元件、脱落酸应答元件和乙烯应答元件。实时荧光定量PCR分析表明,在渗透、高盐、低温、高温和淹水5种逆境胁迫处理下,SiC3H1的表达量与对照相比均显著升高。以上研究结果表明,SiC3H1参与了芝麻对多种逆境胁迫的应答反应,为今后进一步解析其功能提供了理论依据。

植物串联CCCH锌指蛋白RR-TZF家族研究进展及生物信息学分析

典型的串联CCCH型锌指结构蛋白(tandem CCCH zinc finger proteins, TZFs)含有由18个氨基酸分隔的二个串联CCCH motifs (C-X7-8-C-X5-C-X3-H、C-X5-C-X4-C-X3-H)。富含精氨酸的RR-TZF蛋白是植物特有,研究表明RR-TZF蛋白通过介导RNA的降解来调节基因的表达水平,影响植物的生长发育以及胁迫反应。本研究主要综述了植物RR-TZF蛋白在生长发育及胁迫反应中的功能及作用机制等;同时利用生物信息学手段对RR-TZF蛋白进行聚类分析,系统地分析了RR-TZF蛋白从低等植物到高等植物中的进化与保守性,并展望了未来可能的研究方向。为探究CCCH型锌指结构蛋白家族基因在作物中的具体功能及其应对非生物胁迫的分子机制研究提供了重要的理论依据。

布氏锥虫未知CCCH-型锌指蛋白TbZC3H8功能特性的初步分析

目的通过RNAi和蛋白复合物鉴定来初步分析布氏锥虫未知锌指蛋白TbZC3H8的特性及功能。方法运用蛋白数据库和分析软件对TbZC3H8进行序列分析和结构域预测;构建RNAi诱导表达细胞株分析TbZC3H8经RNAi敲低后对锥虫生长的影响,并通过RT-QPCR和Western blot检测RNAi干扰效率;构建异位融合表达myc-TAP标签的TbZC3H8细胞株,采用串联亲和纯化合并质谱鉴定其蛋白复合物组成;采用免疫荧光分析蛋白定位。结果 TbZC3H8的CCCH结构域在动基体原虫中高度保守;RNAi下调TbZC3H8后明显抑制了锥虫复制;TbZC3H8蛋白复合物中包含多种未知蛋白和两种RNA结合蛋白;TbZC3H8蛋白定位于胞质中,血清饥饿和热刺激对其定位无影响。结论 TbZC3H8是锥虫生长必需的,TbC3H8与RNA结合蛋白的相互作用暗示其可能在RNA加工代谢中发挥着作用。

刚毛柽柳ThZFP3基因的克隆及表达特征分析

本研究基于刚毛柽柳转录组数据,克隆获得了一条CCCH型锌指蛋白的全长基因,并命名为ThZFP3。ThZFP3基因开放阅读框(ORF)全长1335 bp,编码444个氨基酸,编码蛋白的分子质量为48.49kDa,理论等电点为8.08。进化树分析结果表明,ThZFP3与川桑和毛果杨ZFP的亲缘关系最近。亚细胞定位结果显示ThZFP3定位于细胞核中。在酵母中,全长ThZFP3没有转录激活活性,但在其羧基端(C端)具有转录激活活性,转录激活域位于C端的56个氨基酸区段。此外,实时荧光定量PCR分析结果显示,ThZFP3的表达受NaCl和PEG的诱导,表明ThZFP3可能参与了刚毛柽柳对盐和干旱胁迫的应答反应。以上研究结果为进一步研究ThZFP3在刚毛柽柳耐盐抗旱中的功能及作用机制提供了依据。

刚毛柽柳ThZFP1基因的克隆和表达分析

CCCH型锌指蛋白是植物中广泛存在的一类转录因子,在植物生长发育、胁迫应答等多种生物过程中发挥重要的调控作用。本研究从刚毛柽柳(Tamarix hispida)中克隆获得一条CCCH型锌指蛋白基因,命名为ThZFP1。该基因开放阅读框(ORF)长870 bp,编码290个氨基酸,推测蛋白质分子质量为30.38 kDa,理论等电点为5.10。ThZFP1属于疏水性蛋白。进化树分析结果表明, ThZFP1与茶树ZFP的亲缘关系最近。实时荧光定量PCR分析结果显示,在NaCl、PEG和ABA处理下,ThZFP1基因的表达量明显上调,表明ThZFP1基因能对高盐、干旱胁迫和ABA处理做出应答。