miR-375靶向锌指蛋白470对人牙周膜干细胞成软骨分化的调控作用

目的探讨miR-375靶向锌指蛋白470(ZNF470)对人牙周膜干细胞(hPDLSCs)成软骨分化的调控作用。方法以诱导成软骨分化培养基诱导hPDLSCs成软骨分化,实时荧光定量PCR法检测成软骨分化诱导1、3、7、14、21 d时miR-375及ZNF470 mRNA的表达,双荧光素酶报告基因检测法分析miR-375与ZNF470的靶向调控关系。将hPDLSCs分为空白对照组、阴性对照组、miR-375过表达组、对照+空载组、miR-375过表达+空载组及miR-375过表达+ZNF470组,分别转染对照激动剂(NC-ago)、miR-375突变激动剂(miR-375-mut-ago)、miR-375激动剂(miR-375-ago)、NC-ago+空载、miR-375-ago+空载以及miR-375-ago+ZNF470载体,转染后对各组细胞进行成软骨分化诱导。采用阿尔新蓝染色观察各组成软骨分化情况,实时荧光定量PCR与Western blotting分别检测软骨标志性基因Ⅱ型胶原α1(COL2A1)、性别决定基因9(SOX9)、软骨可聚蛋白多糖(ACAN)以及透明质酸合酶2(HAS2)的mRNA与蛋白表达水平。结果诱导hPDLSCs成软骨分化过程中miR-375 mRNA表达呈时间依赖性下调,ZNF470 mRNA表达呈时间依赖性上调,miR-375与ZNF470表达呈负相关(r=-0.47,P<0.05)。双荧光素酶报告基因显示,miR-375可靶向负调控ZNF470。阿尔新蓝染色显示,成软骨分化程度miR-375过表达组<空白对照组、阴性对照组,miR-375过表达+空载组<miR-375过表达+ZNF470组<对照+空载组(P均<0.05)。实时荧光定量PCR与Western blotting显示,COL2A1、SOX9、ACAN、HAS2 mRNA与蛋白表达miR-375过表达组<空白对照组、阴性对照组,miR-375过表达+空载组<miR-375过表达+ZNF470组<对照+空载组(P均<0.05),空白对照组与阴性对照组各软骨标志性基因表达差异无统计学意义。结论miR-375能够靶向负调控ZNF470从而抑制hPDLSCs成软骨分化,miR-375可能是调控hPDLSCs成软骨分化的重要分子靶点。