无透明带卵母细胞在辅助生殖领域中的研究进展

在辅助生殖技术的操作过程中,实验室在取卵后往往会观察到无透明带卵母细胞,本文就其产生原因、利用价值、辅助生殖过程中处理方式以及相关研究进展等方面进行综述。

山羊胚胎分割及同卵双生试验

选择山羊晚期桑椹胚、囊胚、孵出囊胚和孵出增大胚泡,用简化分割法二分。将19对裸半胚移植于18只受体羊,结果有12只妊娠,其中两只胚胎消失,两只流产,其余8只足月分娩,共产半胚羔11只。晚期桑椹胚、囊胚、孵出囊胚和孵出增大胚泡各组的半胚发育为羔羊的发育率分别为12.5％(1/8)、20％(2/10)、25％(3/12)和62.5％(5/8)。前三组均未获得同卵双生羔羊。在第四组,将4对裸半胚移植于4只受体,有3只妊娠,足月分娩半胚羔5只,其中两对为同卵双生。本研究证明,对称分割山羊孵出增大胚泡,不仅其半胚在体内仍可继续发育形成正常胎儿,而且不装透明带移植其裸半胚,仍能获得较高的同卵双生率。山羊孵出增大胚泡更适宜用简化分割法分割。

诱导牛精子体外获能的培养基及方法

用去透明带金黄地鼠异种精子体外穿透试验，检测冻精复苏经各种处理后的精子穿卵率。发现在４种基本培养基（ＢＯ、ｍＢＷＷ、ＴＹＨ、ＨａｍＦ１０＋ＲＰＭＩ－１６４０）中不加亚牛磺酸时，牛精子不能耐受较高浓度（４μｍｏｌ／Ｌ）钙离子载体（ＩＡ）的刺激（以１０ｍｉｎ计）；而低浓度ＩＡ（低于４μｍｏｌ／Ｌ）处理精子不能诱导获能。生物活性物质，如肝素、咖啡因、亚牛磺酸、肾上腺素单独或联合低浓度ＩＡ处理精子，短期（６ｈ）内也不能诱导获能。当基本培养基中含有亚牛磺酸时，牛精子能耐受高浓度ＩＡ（１０μｍｏｌ／Ｌ）的刺激，并使牛精子获能；亚牛磺酸与肾上腺素、咖啡因联合使用，并在获能液中添加透明质酸酶时，穿卵率进一步提高，获能效果显著改善。以ＨａｍＦ１０＋ＲＰＭＩ１６４０为主的混合培养基，在牛精子的存活时间、穿卵率等方面优于ＢＯ、ｍＢＷＷ、ＴＹＨ培养基。结果表明，用Ｆ１０和１６４０的混合培养基，添加亚牛磺酸、肾上腺素、咖啡因、透明质酸酶，经１０μｍｏｌ／ＬＩＡ处理牛精子１０～１５ｍｉｎ。

精胺抑制人精子的体外受精能力

以精子穿透去透明带仓鼠卵试验(SPA)为模型,评价了精胺对人精子体外受精能力的影响。精胺(0.25—8.0mmol/L)可抑制人精子体外获能和受精,其抑制作用与精胺浓度呈正相关,此种抑制作用是可逆的。用 HPLC 测定精子精胺含量表明,精子获能后精胺含量明显下降。dbcAMP(0.5—1.0mmol/L)或咖啡因(10mmol/L)可拮抗精胺抑制人精子体外获能。其拮抗作用随 dbcAMP 浓度而增强。钙离子载体 A 23187 2/μmol/L 或胰蛋白酶0.05%均可拮抗精胺抑制人精子穿卵率。上述结果提示,精胺可能通过降低精子 cAMP 含量和抑制钙内流或顶体酶活性,从而阻止人精子体外获能和受精。

化学去核卵母细胞为受体的小鼠体细胞核移植

【目的】本研究旨在探索一种崭新的、化学试剂诱导去核卵母细胞为核受体的、无透明带的、手工体细胞核移植方法。【方法】将第一次减数分裂期小鼠卵母细胞进行诱导去核并去除透明带,去核卵胞质与胎儿成纤维细胞粘合、电融合和SrCl2激活后,体外培养重构胚。【结果】重构胚融合率和激活率分别为84.8%和93.6%;胚胎2-细胞发育率为24.7%,4-细胞率为6.74%;2-细胞期克隆胚移植假孕受体后,没有获得怀孕受体;分别以"血清饥饿"胎儿成纤维细胞、新鲜细胞和冷冻保存细胞为供体作核移植,结果表明,冷冻保存细胞的融合率(69.3%)与其余两组(80.6%和84.8%)呈显著差异(P<0.05);激活率、2-细胞和4-细胞发育率,则3组间差异不显著(P>0.05)。【结论】本文将小鼠卵母细胞的化学去核与无透明带技术相结合,获得的克隆胚目前已发育到4-细胞期;另外,供体细胞的3种准备方式均不影响胚胎发育率。该方法属手工克隆,它的成功将会大大简化核移植程序,提高核移植总效率。

小鼠卵母细胞化学去核及手工构建核移植胚胎

为优化脱羰秋水仙碱(DC)诱导去核程序,研究以DC去核卵母细胞为核受体的、无透明带体细胞核移植方法在小鼠体细胞核移植中的应用,试验比较了乙醇、SrCl2两种激活方法及脱羰秋水仙碱处理开始时间对小鼠MⅡ期卵母细胞去核效率的影响;将DC诱导去核成功的卵母细胞去除透明带,与胎儿成纤维细胞粘合、电融合和SrCl2激活后,体外培养重构胚。结果显示,7%乙醇激活后0 min起始DC处理可得到最高的诱导去核率(66.4%);而在8 mmol/L SrCl2中激活15 min后用DC处理可得到最高的诱导去核率(64.3%);目前重构胚可以体外发育到8-细胞。试验结果首次证明了SrCl2在小鼠卵母细胞DC诱导去核中的作用效果与乙醇相当,初步证明了将DC诱导去核技术与无透明带技术相结合手工克隆生产小鼠重构胚的可能性,它的成功将大大简化核移植程序。

牛去透明带卵体细胞核移植技术的应用研究

本研究通过进一步完善和简化"去透明带双半卵体细胞克隆牛技术",探讨了生产应用的可能性。结果表明:(1)在卵母细胞体外成熟发育的特定阶段(17～20h间)采用分期分批显微盲吸法去核,去核率可高达95%以上;(2)一次同时将2枚去核后的半卵和1枚供核体细胞粘合在一起,可大大提高电击融合效率;(3)克隆重构胚在DMAP中激活时间从4h延长至16h仍有较高的卵裂率和囊胚率;(4)利用OPS法玻璃化冷冻保存牛体细胞克隆胚胎,解冻后胚胎可用率极显著地高于常规慢速冷冻法;(5)利用改进后的体细胞核移植程序工厂化批量生产牛体细胞克隆胚胎,获得88.2%(2575/2920)卵裂率、41.6%(1215/2920)囊胚率、75.4%(916/1215)冻胚率,冷冻胚胎移植后30d妊娠率为28.1%(48/171)。结果说明,本研究的牛去透明带双半卵体细胞核移植技术已可达到克隆胚胎批量生产应用的水平。

乙型肝炎病毒对精子染色体的影响

乙型肝炎病毒感染者的精子与去透明带金黄地鼠卵受精制备染色体，并以ＨＢＶ 全长ＤＮＡ 作探针对精子染色体进行荧光原位杂交。结果发现慢性迁延型肝炎患者、慢性活动型肝炎患者和ＨＢＶ 携带者的精子染色体畸变率分别为１２－３３ ％ （９／７３） 、１６－１８％ （１１／６８） 和１５－４８ ％（１３／４８），均显著高于健康对照者精子畸变率（４ ．３５％ ，５／１１５） 。进一步ＦＩＳＨ 显示，在１ 例慢性迁延型肝炎患者的精子染色体上有特异荧光信号。研究结果表明，ＨＢＶ 能导致精子染色体不稳定性，并在患者精子染色体上整合，其整合特点是：整合位点是随机的，且大多为多位点整合。

人精子穿去透明带金黄地鼠卵实验和精子DNA完整性检测在体外受精-胚胎移植中的应用

目的:探讨人精子穿去透明带金黄地鼠卵实验(SPA)和精子DNA完整性检测在体外受精_胚胎移植术(IVF_ET)助孕中的应用价值。方法:选择兰州大学第一医院生殖医学研究中心,行IVF_ET助孕的不孕不育夫妇中的41名男性,根据不孕不育原因分为完全男方因素引起的不孕不育组(n=20)和完全女方因素引起的不孕不育组(n=21),比较分析两组男方年龄、穿透率、受精指数、IVF受精率、DNA碎片率、卵裂率、优质胚胎率、胚胎着床率及临床妊娠率的差别。结果:完全男方因素引起的不孕不育组和完全女方因素引起的不孕不育组之间,在男方年龄、IVF受精率、卵裂率、胚胎着床率、临床妊娠率等方面的差异均无统计学意义(P均>0.05),在穿透率、受精指数、DNA碎片率方面的差异均具有统计学意义(P<0.05);前者的SPA穿透率与IVF受精率、卵裂率和优质胚胎率之间均存在显著正相关(r=0.908,0.55,0.852,P均<0.05),DNA碎片率与IVF受精率和优质胚胎率均存在显著负相关(r=-0.636,-0.634,P均<0.05);后者SPA穿透率与IVF受精率、卵裂率和优质胚胎率之间均存在显著正相关(r=0.893,0.53,0.626,P均<0.05),DNA碎片率与IVF受精率和优质胚胎率之间均存在显著负相关(r=-0.636,-0.634,P均<0.05)。结论:SPA和精子DNA完整性检测在辅助生殖技术中可能具有一定的应用价值。

人精液的冻贮研究

目的 研究在T-G型冷冻保护剂(Cryopreservative medium, CPM)作用下，速缓冻贮法对人精子结构和功能的影响。方法 随机双盲对照, 将45份正常精液随机分组，加与不加CPM ，以速缓冷冻法分别进行冻贮，冻贮前后分别进行常规分析、低渗肿胀试验、穿卵试验、超微结构观察及精子染色体分析。结果 未加CPM组冻贮后的精液未见有精子复苏, 经冷冻保存的精子质量明显降低，缓冻法对精子的影响显著小于速冻法，精子染色体的畸变率及X/Y精子比例均未见明显变化。结论 速、缓冻贮对人精子均有负面影响，缓冻法优于速冻法，两法对精子染色体畸变率和性染色体比例未产生明显影响。

不同融合参数对小鼠圆形精子细胞与卵母细胞融合胚胎发育的影响

目的利用手工克隆(handmade cloning,HMC)技术对小鼠圆形精子细胞与去透明带卵母细胞进行电融合,以研究电融合参数对融合胚胎发育潜能的影响。方法选取549枚卵母细胞与圆形精子细胞融合,根据电融合参数分为三组:A组(n=186)采用电场强度60V/mm、脉宽30μs、脉冲次数为2次的直流电脉冲;B组(n=188)采用电场强度80V/mm、脉宽20μs、脉冲次数为2次的直流电脉冲;C组(n=175)采用电场强度100V/mm、脉宽10μs、脉冲次数为2次的直流电脉冲。观察记录不同电融合参数下圆形精子细胞与无透明带卵母细胞的融合率、融合胚胎卵裂率以及囊胚形成率。结果(1)A组圆形精子细胞与去透明带卵母细胞的平均融合率为(84.87±3.84)%,与其他两组[(74.93±5.46)%、(73.60±5.48)%]相比平均融合率显著升高(P<0.05);(2)A组融合胚胎的平均卵裂率为(77.37±3.97)%,与B组、C组融合胚胎的卵裂率[(67.74±7.32)%、(66.17±9.87)%]相比显著升高(P<0.05);(3)A组的平均囊胚形成率为(41.28±6.50)%,显著高于C组[(31.03±6.09)%](P<0.05)。结论 A组采用电场强度60V/mm、脉宽30μs、脉冲次数为2的直流电脉冲是圆形精子细胞与去透明带卵母细胞融合的最佳方案,有利于提高胚胎的发育潜能。

有无透明带猪卵母细胞电激活参数的优化及体外培养方式的建立

[目的]摸索无透明带猪体外成熟卵母细胞(ZFOs)电激活的条件和无透明带孤雌激活胚胎(ZFEs)的体外培养方式,为手工克隆法生产广西巴马小型猪体细胞核移植奠定基础。[方法]用不同场强、脉冲时程和脉冲次数激活ZIOs、ZFOs,用不同培养方式(微滴法和微穴法)培养ZIEs和ZFEs,检查第7天的囊胚率及囊胚的总细胞数。[结果]有带猪体外成熟的卵母细胞电激活最佳场强和脉冲时程为125 V/(mm.80μs),微滴法培养的囊胚发育率为(30.54±11.06)%;无带猪体外成熟的卵母细胞电激活最佳场强和脉冲时程为85V/(mm.80μs),微穴法培养,其囊胚发育率为(12.77±6.98)%;单次脉冲的激活效果好于多次脉冲。[结论]对有无透明带胚胎的培养方式,微穴法培养无透明带胚胎,微滴法培养有带胚胎较合适,一次脉冲可以有效激活卵母细胞。

人精子穿透去透明带金黄地鼠卵试验与人精卵体外受精的比较

目的 研究在人工助孕技术中能否以人精子穿透去透明带金黄地鼠卵试验 ( SPA)结果作为确定采用人精卵体外受精 ( IVF)或经卵细胞胞浆内单精子注射 ( ICSI)的指标。方法 对 2 2例准备行 IVF的夫妇男方精子 SPA受精率与其 IVF受精率结果进行比较。结果 SPA和 IVF受精率分别为 38.6 %± 2 3.5 %与 5 3.5 %±2 8.4% ,SPA受精率较 IVF受精率低 ,但随着 SPA受精率的增加 ,IVF受精率也呈明显增加的趋势。在 SPA受精率大于 10 %的病例中 ,约 76 %的病例 IVF受精率大于 5 0 %。经统计学分析两者有显著相关性 ( rs=0 .70 46 ,| U | =3.2 2 84>u0 .0 1 /2 )。结论 SPA受精率可作为助孕技术中确定 IVF或

WOW培养法的研究

WOW培养法是目前培养胚胎的重要方法之一,在去透明带胚胎的培养上尤为重要。将拣卵针烧制成圆球状,在四孔板底烫制WOW,将不同时间去除透明带的牛孤雌激活胚培养于WOW中。结果显示:各组的卵裂率(78.9%、81.1%和78.9%)与对照组无显著差异(P>0.05);移入6-DMAP中之前去除组的囊胚率(31.5%)与移入培养液中之前去除组(32.4%)无显著差异(P>0.05),而且分别与对照组无差异显著(P>0.05);移入离子霉素中之前去除组未得到囊胚。移入6-DMAP中之前去除组囊胚细胞数(113.8±10.1)与移入培养液中之前去除组囊胚细胞数(112.5±8.1)和对照组均无显著差异(P>0.05)。分别5枚、15枚和30枚为一组进行培养,对胚胎的后续发育无显著影响。

冷冻对人精子结构及功能的影响

目的：研究冷冻对人精子结构和功能的影响。方法：采集健康已生育25～35岁男性供精者精液作标本，7.5％单一甘油为冷冻保护剂(Cryopreservative agent,CPA)，每份精液分别采用速、缓降温法冷冻，冻前、后分别作精液常规分析、精尾低渗肿胀试验、精子超微结构、精子穿卵试验。 结果 ：复温后未加CPA者,均未见有复苏存活的精子；加CPA者，精子存活率、活动率、精尾低渗肿胀率、精子超微结构相对完整的百分率、穿卵率均显著下降,速冻法比缓冻法下降更明显。结论：7.5％单一甘油对人类精子具有显著的冷冻保护作用，精液冻贮对精子的结构及功能均有不同程度的损害，不同的降温速度对人精子产生不同的冷冻损伤，缓冻法降温冻贮人类精液的方法简单经济，能较好地较长时期地保持人精子功能和结构完整性。

精索静脉曲张不育患者术后未育者精子穿卵率的远期观察

目的 :对精索静脉曲张不育患者术后未育者的精子穿卵率作远期观察。方法 :1双侧经髂窝或经腹腔镜精索静脉高位结扎术 ;2人精子去透明带地鼠卵穿透试验 (SPA)。结果 :2 9例精索静脉曲张不育患者 ,术后 1 .5～ 2年随访仍未育 ,作 SPA,与术前 SPA穿卵率对比 ,精索静脉曲张 °组 (n=1 7)有 7例改善了穿卵率 ,精索静脉曲张 °组 (n=1 2 )有 2例改善了穿卵率。但两组穿卵率的升高幅度不大。结论 :精索静脉曲张不育患者术后较长时间仍未育者 ,虽部份患者的精子穿卵率已有改善 ,但穿卵率的增加程度不高。术前精索静脉曲张严重的患者 ,术后可能难以提高穿卵率。应建立 SPA对患者术后精子受精能力作评估 ,以及时调整治疗措施。

无透明带核移植技术

近几年,虽然体细胞核移植研究取得了巨大的成就,但是基本上沿用Willadsen最初的方法——去核、注核、融合和激活。而且所获得的克隆动物往往会出现很多问题如器官发育异常等,其中的原因不清。因此,人们试图革新原有的核移植方法,并建立了新的核移植方法——无透明带核移植法,以期提高核移植的效率及解决核移植中存在的问题。现对无透明带核移植技术的两种方法——反向核移植法和手工核移植法以及单个胚胎培养系统进行介绍。

有无透明带牛卵母细胞孤雌发育研究

研究探讨了不同浓度的钙离子载体 (A2 3187)结合 6 二甲氨基嘌呤 (DMAP)或丁内酯I (BL -I)激活处理对有或无透明带牛卵母细胞孤雌发育的影响。结果表明 :使用A2 3187浓度从 0 .6 2 5～ 10 .0 0 0 μmol/L配合 2 .0mmol/LDMAP孤雌激活牛具透明带卵均能获得良好的卵裂及早期胚胎发育效果 ;对于去透明带卵来说 ,使用 0 .6 2 5 μmol/L浓度的A2 3187激活效果最佳。BL I的激活效果则明显差于DMAP ;当采用 0 .3%PVA取代激活液中的 5 %血清时 ,BL I的激活效率显著提高。

核移植方法和维生素C影响绵羊克隆胚胎体外发育

旨在研究绵羊体细胞核移植过程中,不同核移植方法及胚胎培养液中添加维生素C对绵羊克隆胚胎生产效率的影响,为优化绵羊体细胞克隆技术体系提供试验依据。用屠宰场采集的绵羊卵巢为试验材料,经卵母细胞体外成熟后进行核移植操作,采用微电极融合、无透明带克隆与显微注射等核移植方法,比较胚胎构建效率,利用绵羊孤雌胚胎摸索发育液中添加维生素C最适浓度,将该浓度用于克隆胚胎体外培养,统计胚胎发育情况。结果表明:采用25V微电极融合法融合率显著高于平行电极融合法(P<0.05),但与30V电压差异不显著。25V电压微电极融合法死卵率显著低于30V融合法(P<0.05);无透明带构建克隆胚胎的桑椹胚率显著高于显微注射法(P<0.05),但囊胚率差异不显著(P>0.05);胚胎培养液中添加50μmol·L-1维生素C显著提高了孤雌激活与体细胞克隆胚胎囊胚率(P<0.05)。综上所述,微电极融合法可显著提高绵羊体细胞核移植融合效率,无透明带构建方法不能显著提高克隆胚胎囊胚率,胚胎培养液中添加50μmol·L-1维生素C可显著提高绵羊克隆胚胎囊胚率。

化学去核卵母细胞为受体的小鼠体细胞核移植

卵母细胞的化学去核是采用干扰染色体分离或纺锤体正常功能的化学试剂,使其所有染色质通过纺锤丝牢固结合,并借助极体排出的惯性将所有染色质全部带出胞外,达到去核目的。目前以化学去核处理的MⅡ期卵母细胞为受体,已获得克隆小鼠。然而,第一次减数分裂期的小鼠卵母细胞经化学去核后,进行核移植还未见报道。与传统的机械去核相比,该方法对卵母细胞无机械损伤,完全是极体的自然排放;同时细胞质及其中核重编程相关因子损失量小;而且高效、省时,程序简单,所得的卵胞质或许更适合于供体细胞核的重编程。剪取超排小鼠的卵巢,以注射器刺破有腔卵泡后获得卵母细胞和卵丘细胞复合体,进行体外成熟培养。成熟培养5 h后去除卵丘细胞,挑选生发泡破裂的细胞顺序移入含脱羰秋水仙碱(DC,0.4μg/mL,2 h)和DC(0.4μg/L)+放线菌酮(CHX,50μg/mL)的M16培养液中继续培养,直到第一极体排出。去核卵胞质与胎儿成纤维细胞用植物凝集素(PHA,200μg/mL)粘合后,转入电击槽;施加1个5 V/mm、3μs交流电脉冲和2个92 V/mm、70μs直流电脉冲进行电融合。3 h后,以SrCl2激活6h,于四孔培养皿中制作的“孔中孔”(well of well)体外培养重构胚。试验重复3次,共计698个卵母细胞,获得的重构胚融合率和激活率分别为84.8%和93.6%;胚胎2-细胞发育率为24.7%,4-细胞率为6.74%;2-细胞期克隆胚移植假孕受体后,没有获得怀孕受体。试验分别以“血清饥饿”胎儿成纤维细胞、新鲜细胞和冷冻保存细胞为供体作核移植,结果表明,冷冻保存细胞的融合率(69.3%)与其余两组(80.6%和84.8%)呈显著差异(P<0.05);激活率、2-细胞和4-细胞发育率,则三组间差异不显著(P>0.05)。本研究将化学去核与无透明带技术相结合,完全丢弃了传统核移植的显微操作及其繁琐程序,属手工克隆,它的成功将会大大简化核移植程序,同时提高了核移植的生产力,最终提高核移植总效率。