鱼类致病鰤鱼诺卡氏菌(Nocardia seriolae)的LAMP检测技术建立与应用

针对鰤鱼诺卡氏菌16S—23SrRNA基因内转录间隔序列,设计了四条LAMP引物,在外内引物浓度比1:8、dNTP浓度0.8—1.2mmol/L、Mg2+浓度10—14mmol/L、反应温度60—65℃、反应时间60min的优化条件下,扩增产物经电泳后呈现特异性的LAMP梯形条带,建立的LAMP法具有高灵敏度,达到10-7μg/μlDNA浓度,比常规PCR方法高100倍。将该方法应用于取自养殖场的乌鳢、大黄鱼、黄姑鱼组织样品检测,结果在16份组织样品中有7份检出自然感染的鰤鱼诺卡氏菌,与同步取样品鱼组织的细菌分离、培养检查结果相一致,并显示既能检测发病鱼,又能检出未发病且已感染的病鱼。分析表明,这是一种能快速、简易、特异、敏感的检测鱼类致病鰤鱼诺卡氏菌的诊断方法。

养殖大黄鱼病原弧菌多重PCR检测技术的建立和应用

溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)、副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)和哈维氏弧菌(Vibrio harveyi)是浙江省养殖大黄鱼(Pseudnosciaena crocea)弧菌病的主要致病菌。本研究选择针对溶藻弧菌和副溶血弧菌的胶原酶基因,哈维氏弧菌的部分ToxR基因的特异性,优化设计了3对特异性引物,通过进行多重PCR反应体系优化,多重PCR产物的测序鉴定与特异性和敏感性实验,建立了一种检测致病性弧菌的多重PCR检测方法。经过琼脂糖凝胶电泳后的条带分析判断,可以在一个PCR管中同时成功地检测这3种病原细菌,含溶藻弧菌、哈维氏弧菌和副溶血弧菌3种致病弧菌核酸的阳性对照样品分别扩增出大小为737bp、382bp和271bp的预期产物,其灵敏度是102～103CFU/mL。将该方法应用于检测人工感染后的养殖大黄鱼病鱼肝脏和肾脏,结果在6份组织样本中,5份检出原始感染菌株,与API20E鉴定结果相符;对弧菌病流行季节采集的未发病的16份养殖大黄鱼组织样本和16份水体样本进行抽检,结果在1份大黄鱼组织样本中检出哈维氏弧菌,7份水体样本中检出这3种弧菌中的1种或2种,鉴定结果与API20E鉴定结果符合率为93.75%。说明该方法不仅可以检测发病鱼,还可以检测无病症带菌大黄鱼以及带菌水样,且说明海洋水体中存在着大黄鱼弧菌病的致病菌。结果说明,多重PCR检测方法具有较高的敏感性与特异性,可以缩短检测时间,降低检测成本,该方法的建立对养殖大黄鱼弧菌病的快速诊断和分子流行病学的调查具有重要意义。

曼氏无针乌贼的海水网箱养殖技术

曼氏无针乌贼（Sepiella maindronide Rochebrune）俗称乌贼、墨鱼、墨斗鱼、海猫等,隶属软体动物门,头足纲,十腕目,乌贼科,无针乌贼属。在中国东、黄渤海均有分布。

曼氏无针乌贼水泥池养殖技术

曼氏无针乌贼（Sepiella maindroni de Rochebrune）俗称墨鱼，属软体动物门、头足纲、十腕目、乌贼超科、乌贼科、无针乌贼属。2004年宁波大学突破曼氏无针乌贼人工育苗技术后，又获得了曼氏无针乌贼的海水围塘养殖、水泥池养殖及网箱养殖成功，本文就水泥池养殖技术作一介绍。

温度胁迫对三疣梭子蟹血清中非特异性免疫因子的影响

以同期普通三疣梭子蟹Portunus trituberculatus(以下简称普通蟹RS)为对照,研究了低温(8℃)和高温(34℃)胁迫12 h内经溶藻弧菌感染后筛选的抗病候选群G2代三疣梭子蟹(以下简称筛选蟹G2S)的血蓝蛋白含量,以及血清中超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化物酶(POD)、过氧化氢酶(CAT)、碱性磷酸酶(AKP)和酸性磷酸酶(ACP)活力的变化。结果表明:温度骤变后,筛选蟹G2S和普通蟹RS的血蓝蛋白含量在3 h时均达到峰值(P<0.05),随后又逐渐下降,到3～12 h时已基本恢复到0 h的水平(P>0.05)。两组蟹的SOD和AKP在低温、高温胁迫3 h内也均显著下降(P<0.05),到3～12 h达到稳定的低水平(P>0.05);在温度骤变的胁迫下,POD、CAT和ACP活力随时间变化也基本呈峰值变化,但达到峰值和趋于稳定的时间不具同步性。方差分析结果显示,筛选蟹G2S的免疫指标值均显著高于普通蟹RS(P<0.05),说明筛选蟹G2比普通蟹RS在非特异性免疫因子方面更具免疫优势。以上结果表明:温度骤变的短期胁迫会影响机体的生理功能和机体的免疫防御能力,导致自由基代谢紊乱,从而诱导病害发生。

投喂四种饵料对曼氏无针乌贼(Sepiella maindroni)繁殖性能的影响

以双齿围沙蚕、泥鳅、黄鲫、福寿螺4种不同饵料强化培育胴长(6.50±0.20)cm的曼氏无针乌贼,用曼氏无针乌贼肝脏和卵巢的氨基酸与脂肪酸变化、亲体产卵量、卵径、卵子孵化率及其幼体成活率等指标来评价4种饵料对其繁殖性能的影响。结果表明,黄鲫组曼氏无针乌贼肝脏与卵巢中∑EAA、∑SEAA、∑EAA+SEAA、∑NEAA、∑AA含量在第一次卵巢成熟与第二次卵巢成熟时均显著高于其它投喂组(P<0.05)。黄鲫组乌贼肝脏DHA/EPA在第一次卵巢成熟时显著高于其它投喂组,在第二次卵巢成熟时DHA、DHA/EPA、∑n3PUFA、∑n6PUFA、∑n3/n6PUFA都显著高于其它投喂组(P<0.05);该组乌贼第一次卵巢成熟卵巢DHA、∑n3PUFA、∑n6PUFA、∑n3/n6PUFA及在第二次卵巢成熟时卵巢DHA、DHA/EPA、∑n3PUFA、∑n3/n6PUFA均显著高于其它投喂组(P<0.05),该组第二次卵巢成熟时∑n6PUFA百分含量与沙蚕组无显著差异(P>0.05)。产卵量多少顺序为黄鲫组>沙蚕组>泥鳅组>福寿螺组(P<0.05);孵化率高低顺序为黄鲫组>福寿螺组>泥鳅组>沙蚕组(P<0.05);所产卵子平均直径大小顺序为黄鲫组>泥鳅组>沙蚕组>福寿螺组(P<0.05);幼体成活率高低顺序为黄鲫组>泥鳅组>沙蚕组、福寿螺组(P<0.05)。各指标吻合程度高。

养殖大黄鱼(Pseudosciaena crocea)3种致病弧菌的分子鉴定及其系统发育学分析

从患病养殖大黄鱼分离到3株病原菌H040823-1、H050704-1、H050815-1,经常规生理生化鉴定均属于弧菌属的种类,API20E快速鉴定菌株H040823-1为副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyti-cus),菌株H050815-1为溶藻弧菌(V.alginolyticus),菌株H050704-1不在API20E鉴定谱内。为了进一步确定其分类地位,测定了3株病原菌的16S rRNA和HSP60(heat shock protein,HSP60)基因部分序列。16S RNA基因系统进化分析表明,3株病原菌与副溶血弧菌、哈维氏弧菌、溶藻弧菌亲缘关系较近,相互之间同源性均大于96.9%,差异不明显。HSP60基因序列分析表明,菌株H040823-1、H050704-1、H050815-1的HSP60基因序列分别与V.parahaemolyticus(AF230951)、V.harveyi(EU036994)、V.alginolyticus(DQ664545)的同源性最高,分别为96.7%、99.8%和98.0%,而与其他弧菌HSP60基因的同源性均低于91.9%,3株病原菌相互之间同源性低于92.3%,差异显著。HSP60基因构建的系统进化树表明,H040823-1、H050704-1、H050815-1分别与V.parahaemolyticus、V.harveyi、V.alginolyticus聚类。综合以上结果,菌株H040823-1、H050704-1、H050815-1可分别鉴定为副溶血弧菌、哈维氏弧菌、溶藻弧菌。结果表明,HSP60基因比16S rRNA基因更适合用于海水鱼类致病性弧菌种间的分类研究。

饥饿对曼氏无针乌贼肝脏与卵巢脂肪酸组成的影响

在曼氏无针乌贼(Sepiella maindroni)性腺成熟阶段(4～5月)对其进行饥饿处理,以空腹处理组饥饿0d(禁食1d)、饥饿12d(禁食13d)和饥饿24d(禁食25d)为取样时间取其肝脏和卵巢组织进行脂肪酸组成及质量分数测定。结果表明,随着饥饿时间的延长,乌贼体质量下降,肝脏和卵巢萎缩,肝脏中的饱和脂肪酸(SFA)和单不饱和脂肪酸(MUFA)较空腹处理组有显著下降(P<0.05),而多不饱和脂肪酸(PUFA)和高不饱和脂肪酸(HUFA)均有显著提高(P<0.05)。与肝脏相比,乌贼卵巢中的各脂肪酸组成在饥饿12d变化较小,饥饿24d时∑SFA较空腹处理组有极显著下降(P<0.01),而∑MUFA、∑PUFA+∑HUFA和∑n-6PU-FA显著高于空腹处理组(P<0.05)。

东海原甲藻(Prorocentrum donghaiense)对中华哲水蚤(Calanus sinicus)摄食和消化酶活性的影响

采用单养和混养的方法,在实验条件下研究了东海原甲藻对中华哲水蚤摄食和消化酶活性的影响。结果表明:(1)中华哲水蚤对东海原甲藻存在一定摄食行为,藻类密度对摄食率有明显的影响。实验密度下,中华哲水蚤对东海原甲藻的最大摄食率为930cells/(ind·h)。滤水率随着藻密度的增加而呈单一性的下降;(2)混养条件下,中华哲水蚤对金藻和东海原甲藻的摄食率均较单养时下降,滤水率的变化与摄食率相似;(3)不同藻密度下,昆布多糖酶活性都明显高于麦芽糖酶和纤维二糖酶的活性,而麦芽糖酶活性又稍高于纤维二糖酶的活性。与金藻相比,东海原甲藻实验组中华哲水蚤3种消化酶活性明显升高(P<0.05)。

网箱养殖海区底泥产芽孢细菌多样性

采用培养与16S rRNA基因序列比对的方法,对海水网箱养殖区底泥中的可培养细菌进行研究。结果表明,网箱正下方的产芽孢细菌比例高达50%,随着离网箱距离的增加,产芽孢细菌的比例明显降低,200m远时,其比例降至17%。从3个采样点分离纯化出91株产芽孢细菌,对其菌落形态、菌体形态的研究和部分菌株16S rRNA基因的DGGE带型和序列分析表明,91株产芽孢细菌中,有85株属于芽孢杆菌属(Bacillus)的10个种,25个发育型;6株属于盐芽孢杆菌属(Halobacillus)的1个种,3个发育型。芽孢杆菌属的B.marisflavi、B.baekryungensis、B.aquaemaris、B.pumilu等4个种为优势类群。此外,接近半数的产芽孢细菌能代谢含硫化合物,部分菌株能够还原硝酸盐或分解无机磷化合物,仅有3株菌具有亚硝酸盐还原作用。

泥蚶(Tegillarca granosa)肉质的蛋白组学研究

采用双向电泳技术,对广东阳江和浙江乐清两地的泥蚶肌肉全蛋白进行了研究,并利用质谱和软件对差异蛋白进行了分析。研究结果表明,阳江和乐清两地样品平均检测到的蛋白点数分别为674±25和746±34个,平均匹配率为78.6%。差异表达蛋白质点数为26个,其中3个点仅在阳江泥蚶中表达,5个点仅在乐清泥蚶中表达;6个点在阳江泥蚶中为高表达,12个点在阳江泥蚶中为低表达。选择其中6个具有代表性的蛋白点进行肽指纹图谱分析。结果显示,乐清泥蚶中高表达的4个蛋白确定为肌动蛋白、PRKA激酶锚定蛋白9、烯醇化酶。这些物质与泥蚶的肉质特性有一定关联。乐清地区出产的泥蚶在营养、肉质和鲜美度方面均优于阳江地区的泥蚶。

舟山渔场渔业资源可持续利用水平的灰色评价与预测

采用灰色系统理论对渔业资源可持续利用水平的评价和预测方法进行了探讨,建立了渔业资源可持续利用水平的灰色聚类评价模型和灰色BP(误差反向传播)神经网络预测模型。在此基础上,根据舟山市1954—2005年有关渔业资源环境、经济和社会状况的指标,对舟山渔场渔业资源可持续利用水平进行了评价与预测,阐述了舟山渔场渔业资源可持续利用水平的变化过程。对舟山渔场渔业资源可持续利用水平的预测结果表明,由灰色BP神经网络预测模型预测的平均相对误差为1.88%。

耗氧率及溶氧胁迫对长蛸体内酶活力的影响

采用Winkler法测定水中溶氧含量,通过比较对照呼吸室与试验呼吸室水中溶解氧含量之差,测定长蛸(Octopus variabilisSasaki)耗氧率及窒息点,并在不同程度的溶氧胁迫下测定长蛸体内多种酶的活力变化。结果表明,长蛸耗氧率在一个昼夜内呈现'低-高-低-高'的趋势;耗氧率与水温(10~30℃)呈正相关,与pH值(6.40~9.20)呈负相关;随着盐度的升高(14~31),长蛸耗氧率表现为两头高、中间平稳,曲线呈凹状分布;雌性长蛸耗氧率高于雄性。窒息点随长蛸体重的增加而降低,平均体重为(30.50±6.03)g的长蛸窒息点为0.4179mg/L;平均体重为(54.50±4.65)g的长蛸窒息点为0.3902mg/L;平均体重为(97.00±11.36)g的长蛸窒息点为0.2738mg/L。随着溶氧胁迫程度的增加,LDH活力呈先升后降趋势,脂肪酶活力下降,SOD、POD、CAT、ACP、AKP和蛋白酶活力均呈'降-升-降'的趋势。

网箱养殖大黄鱼(Pseudosciaena crocea)疾病与环境因子的关系

根据2001—2005年对舟山市网箱养殖大黄鱼的养殖情况、发病情况、死亡情况和海区环境因子的监测以及收集的气象资料,对疾病与环境因子的关系进行了研究,探索了环境因子及其变化对大黄鱼发病率的影响。结果表明,大黄鱼的发病率和发病类型与气温、风速有关;发病率与水温(>20℃)、悬浮物、化学耗氧量(chemical oxygen depletion,COD)、细菌数均呈显著的正相关,与透明度呈显著的负相关。通径分析显示,对大黄鱼发病率直接效应最大的是水温,其次是风速。通过分析,推测引起舟山市网箱养殖大黄鱼疾病多发的主要原因是网箱养殖本身造成的水体污染,从而提出了舟山市网箱养殖大黄鱼疾病预防的主要措施。

三疣梭子蟹养殖池塘水体中异养细菌菌群特征的研究

对三疣梭子蟹养殖池塘水体异养细菌的数量和菌群组成进行了调查分析.分离得到240株细菌,根据其菌落和菌体形态特征,分为15个类群和31个亚群.结果表明:自然水体进入养殖池塘后,其优势菌菌群和亚群都发生了显著改变,这些改变可能与池塘高有机质的分解和蟹病的发生有密切关系.

UV-B辐射对强壮前沟藻(Amphidinium carterae)和等鞭金藻(Isochrysis galbana)种间竞争的影响

采用共培养的方法,研究了UV-B辐射对不同起始密度强壮前沟藻和等鞭金藻种间竞争的影响。结果表明,在单养时,随着起始密度的增加,2种微藻在生长过程中进入指数生长期和平台期的时间逐渐缩短,所达到的最大种群密度都依次降低。在混养时,当接种比例为A∶I=1∶4和A∶I=1∶1时,等鞭金藻在种间竞争中占有优势;当接种比例为A∶I=4∶1时,强壮前沟藻占有优势。UV-B辐射对两种微藻的种间竞争存在明显的影响。接种比例为A∶I=1∶4时,随着UV-B辐射时间的延长,等鞭金藻对强壮前沟藻的竞争优势逐渐降低,接种比例为A∶I=4∶1时,强壮前沟藻的竞争优势有所加强。

长蛸人工育苗研究

长蛸（Octopus variabilis），俗称章鱼、望潮，隶属于头足纲、八腕目、蛸科、蛸属（章鱼属），为浙江北部沿海蛸类中的主要经济种。其肉质鲜美，营养丰富，可食部分极高。长蛸在国内市场上价格较高，十分畅销，活长蛸尤其受人亲睐。由于过度捕捞，长蛸资源逐渐衰退，捕获量日益减少。长蛸的瓶装养殖虽已在福建等地成功，

野生与养殖曼氏无针乌贼肌肉的营养成分和评价

野生曼氏无针乌贼（Sepiella maindroni）资源越来越稀缺，需要人工养殖。本研究比较野生曼氏无针乌贼与第六代养殖乌贼的营养成分，为人工养殖提供科学依据。

产油微藻的筛选及中性脂动态积累过程的检测

微藻被认为是制备生物柴油燃料的理想原料。本文利用尼罗红染色法对宁波大学种质库63株微藻进行筛选,并跟踪中性脂的动态积累过程。得到产油最高的前三种藻为假微型海链藻(Thalassiosira pseudonana)、蛋白核小球藻(Chlorella pyrenoidosa)和绿色巴夫藻(Pavlovaviridis)。而且三种微藻细胞内的中性脂均在指数生长后期或平台期开始大量积累。利用透射电镜观察假微型海链藻不同生长时期脂肪体的变化,结果与尼罗红染色法检测到的中性脂积累情况一致。本研究筛选出的中性脂含量最高的假微型海链藻,在进一步获取其最佳产油培养条件后可能具有开发利用前景。

渔业资源动态的综合时序模型

渔业资源的变动是一个随机过程,它既有确定性趋势,又有随机波动的特性。论文把灰色系统方法和时序分析相结合,用灰色GM(1,1)模型提取渔业资源变动中的确定性趋势,用时序模型描写它的随机波动,从而建立渔业资源动态的灰色时序模型。考虑到渔业资源的变化受到捕捞强度的影响,同时建立渔获量和单位捕捞努力量的渔获量(CPUE)关于捕捞努力量的二元时序模型。利用灰色时序模型和多元时序模型,对舟山渔场渔业资源的动态变化进行分析和预测,结果表明灰色时序模型和多元时序模型能很好地拟合渔业资源的变动过程,精确地预测渔业资源未来的状况。