整形外科医学生动物实验教学模式与体会

整形外科是一门为人体畸形或缺损进行修残补缺，达到修复形态、重建功能的外科专业，其手术特点就是强调手术操作要精细、准确、手术创伤小等要求。为此，外科手术学实验课程的开设必须与迅速发展的整形外科技术相结合，其教学内容的设置既要有整形外科实验教学内容，又要有显微外科实验教学内容，二者相互融合，相辅相成，对于提高医学生整形外科操作技术和动手能力起着重要的作用［1］。下面从几个方面来浅谈整形外科实验课程的教学模式与体会。

两种牙科材料对人胚胎干细胞来源成纤维细胞的细胞毒性研究

目的:观察口腔常用材料氢氧化钙(calcium hydroxide,CH)和复合树脂对人胚胎干细胞来源成纤维细胞(embryo body fibroblasts-H9,EBf-H9)、原代培养人牙髓细胞(human dental pulp cells,hDPCs)及小鼠成纤维细胞L929的细胞毒性,探讨使用EBf-H9评价牙科材料生物安全性的可行性。方法:诱导人胚胎干细胞(H9)分化为EBf-H9,原代培养hDPCs,并经免疫细胞化学染色鉴定。用细胞计试剂盒-8(cell counting kit-8,CCK-8)检测比较梯度浓度CH和复合树脂浸提液对EBf-H9、hDPCs和L929细胞的细胞毒性。结果:CH或复合树脂分别作用24 h和48 h(或72 h)之后,L929细胞的存活率显著低于EBf-H9和hDPCs(P<0.05),但EBf-H9和hDPCs的细胞存活率没有统计学差异(P>0.05)。结论:对于CH和复合树脂的毒性反应,L929细胞与hDPCs有较大差异,EBf-H9比L929细胞更接近hDPCs的反应,提示在牙科材料生物安全性评价中,人胚胎干细胞来源成纤维细胞具有替代现有细胞检测模型的潜力。

EGFP和CM-Dil示踪骨髓间充质干细胞构建组织工程骨的体内研究

目的:应用增强型绿色荧光蛋白(Enhanced green fluorescent protein,EGFP)和CM-Dil标记技术,观察组织工程骨在体内形成过程中种子细胞的变化和转归。方法:分别用EGFP慢病毒表达和CM-Dil染料的方法标记比格犬骨髓间充质干细胞(Bone mesenchymal stemcells,BMSCs),MTT法检测标记细胞的体外增殖能力。BMSCs接种珊瑚支架体外成骨诱导7天后,将未标记组、EGFP组和CM-Dil组分别植入裸鼠背部皮下,空白支架作为阴性对照。术后4、8、12周取材,HE染色观察成骨情况,EGFP组采用GFP免疫组化、CM-Dil组冰冻切片荧光显微镜下示踪BMSCs在体内的变化。结果:两种标记技术能高效标记BMSCs,标记前后细胞的体外增殖无显著性差异(P>0.05)。细胞-支架复合物植入体内12周后有新生骨形成,标记细胞数量随时间延长而逐渐减少,12周后仍显示有部分标记细胞存活。结论:EGFP和CM-Di l可用于示踪组织工程种子细胞,通过示踪说明BMSCs在体内组织工程骨成骨过程中发挥了重要作用。

骨髓间充质干细胞对自然衰老小鼠T细胞的调节作用研究

目的:研究探讨小鼠骨髓间充质干细胞对自然衰老小鼠T细胞的节作用影响情况。方法:通过流式细胞术研究对比衰老小鼠和年轻小鼠T细胞培养48h后CD8+CD28+的共表达率差异,根据以上研究结果分别对比隔离共培养组、混合共培养组和对照组之间T细胞上CD8+CD28+的共表达率差异。结果:实验一中衰老组培养48h后CD8+CD28+共表达率为(4.08±0.3493)%,年轻组培养48h后CD8+CD28+共表达率为(5.04±0.5741)%。两者相比有统计学差异(P<0.05)。实验二隔离共培养组中骨髓间充质干细胞与淋巴细胞以1:1在Transwell系统中共培养,48h后其对应的CD8+CD28+共表达率为(10.26±1.0784)%,混合共培养组中骨髓间充质干细胞与淋巴细胞以1:1比例在六孔板中共培养,48h后CD8+CD28+共表达率为(6.42±1.5680)%。对照组中淋巴细胞以106数量进行培养,48h后CD8+CD28+共表达率为(4.08±0.3493)%。两两对比有统计学差异(P<0.05)。结论:衰老小鼠和年轻小鼠的T细胞在CD8+CD28+的共表达比例上存在差异。骨髓间充质干细胞能够通过分泌的某些细胞因子使这种衰老的T细胞变得趋向于"年轻态"。

大鼠牙髓干细胞与骨髓间充质干细胞分化成骨样细胞能力对比研究

目的:以骨髓间充质干细胞作为参考,讨论牙髓干细胞作为骨组织修复种子细胞的可行性。方法:通过酶消化法获得大鼠牙髓干细胞,离心法获得骨髓间充质干细胞,贴壁培养,通过倒置光学显微镜观察二者形态差异;流式细胞技术鉴定骨髓间充质干细胞的间质细胞表面标志物表达;MMT法检测细胞生长曲线;特定的成骨诱导液诱导干细胞成骨分化,免疫荧光法检测成骨细胞表面标志物表达。结果:分离的大鼠骨髓间充质干细胞与牙髓干细胞形态学以及生长特性具有相似性,且符合间充质干细胞特性,牙髓干细胞第4天进入对数生长期,第7天进入平台期,骨髓间充质干细胞第4天进入对数生长期,第8天进入平台期;经过成骨诱导后二者都具备成骨样细胞分化能力,牙髓干细胞在成骨诱导后的骨钙素表达上与骨髓间充质细胞有着相似的能力;牙本质泌涎蛋白表达阳性。结论:牙髓干细胞具有与骨髓间充质干细胞都具有成骨分化能力,但牙髓干细胞细胞成分相对复杂,增殖能力较强。

脂肪间充质干细胞治疗皮肤老化的研究进展

脂肪间充质干细胞(Adipose-Derived Stem Cells,ADSC)是来源于脂肪组织的多能干细胞,具有自我更新和多向分化能力,并能分泌多种生物活性因子,在组织损伤、修复方面蕴含着广阔的应用前景。近年来,ADSC在抗皮肤老化方面的作用也被证实。本文就ADSCs在皮肤抗皱、美白、促进毛发再生、增强组织修复能力等方面的研究现况进行综述。

显微外科动物手术教学方法改进的探讨

显微外科技术是近年来兴起并不断成熟普及的一项重要的外科基本技能。它的特点在于，借助光学放大，使外科技术从宏观世界进入微观世界，弥补了肉眼情况下手术的不足，大大提高了手术成功率，从而被广泛应用到多个外科领域[1-2]。要想成为一名合格的外科医生，必须具备熟练的显微外科操作技术。而显微外科动物实验课的教学，是掌握显微外科技术的重要途径，是理论到实践的桥梁课程，对培养高素质、高水平的医疗人才有着重要的现实意义。因此在教学过程中，为了提高教学质量，培养研究生的学习兴趣，我们对教学方法进行了一些改进，并取得了比较满意的教学效果。

骨髓间充质干细胞的免疫学特性及其同种异体的应用研究进展

骨髓间充质干细胞(Bone mesenchymal stem cells,BMSCs)具有多向分化潜能,低免疫原性,同种异体移植后能够调节机体免疫,因此逐渐成为再生医学和免疫学研究的热点。同种异体BMSCs(Allogeneic,allo-BMSCs)在再生医学、组织工程和免疫调节等方面的应用研究显示出了广阔的发展前景,但在进入临床应用前还有很多问题需要解决。本文就骨髓间充质干细胞的免疫学特性及其同种异体的应用研究进展进行综述。

应用小室模型再生毛发的实验研究

目的建立毛囊重建小室模型,并应用该模型进行毛发再生实验研究。方法制备小室模型,分离C57BL/6新生小鼠的表皮和真皮细胞,混合后注入小室内。7 d后拆除小室,并观察创口部位的毛发再生情况。30 d后对创口部位皮肤取材,行HE染色,观察其形态结构。结果裸鼠小室植入部位创面愈合并可见毛发再生,新生毛发大体观和镜下观与正常毛发无明显差异,且排列极性、生长密度良好。对部分无毛发再生的创面进行分析,发现模型构建过程中小室植入的位置对毛囊再生具有重要的影响。结论应用小室模型和新生鼠表皮真皮细胞可以成功实现毛发再生,小室模型是一种可用于毛囊再生研究的良好动物模型,且小室的植入位置对该模型的成功与否具有重要影响。

人骨髓间充质干细胞体外成骨分化过程中成骨相关基因的动态表达

目的:系统研究人骨髓间充质干细胞(hBMSCs)体外成骨诱导分化过程中成骨相关基因的表达变化。方法:应用密度梯度离心法分离hBMSCs,取第2代细胞通过流式检测及多向诱导分化方法进行干细胞鉴定;应用RT-PCR法对hBMSCs在体外成骨诱导不同时间点的成骨相关基因表达进行检测。结果:第2代hBMSCs表达间充质干细胞表面标志CD44、CD90,具有成脂和成骨分化潜能。成骨相关基因在诱导早期部分表达,中期均有表达,基因表达大部分在14天达高峰,与矿化相关的基因表达在21天达高峰。结论:hBMSCs体外成骨诱导过程中成骨相关基因呈动态表达,其表达时序与成骨细胞生理发育基本相似。

人胚胎干细胞向肌腱细胞分化方法的专家共识

胚胎干细胞具有无限增殖能力，可能为组织工程提供肌腱细胞或肌腱祖细胞的来源。为规范人胚胎干细胞来源的肌腱细胞的分化方法，提高人肌腱细胞的纯度，保证分化方法的可重复性，使其更系统、规范和有效地应用于临床和生物安全性评价体系中，科技部国际合作专项有关专家制定了《人胚胎干细胞向肌腱细胞分化方法共识》。共识建议通过两步法将人胚胎干细胞诱导为肌腱细胞：首先利用不同材料表面将人胚胎干细胞诱导为成体间充质干细胞，然后采用高密度种植形成无支架组织工程肌腱，并利用静态或动态力学刺激在体内外环境下将成体间充质干细胞诱导成肌腱细胞。由此建立的体外组织工程肌腱可作为检测评价模型。对小分子化合物、医用材料和药物进行肌腱相关的毒理学系统分析和安全性评价。

荧光活性染料(CM-Dil)对人骨髓间充质干细胞增殖能力的影响

目的:体外分离、培养人骨髓间充质干细胞(human bone marrow derived mesenchymal stem cells,hBMSCs),探讨应用不同浓度氯甲基苯甲酰氨荧光染料(CM-Dil)对hBMSCs增殖力的影响。方法:采用Ficoll梯密度离心法分离、培养hBMSCs,并促进其分别向成骨细胞、脂肪细胞分化;应用不同浓度CM-Dil分别标记第3代hBMSCs,观察不同浓度标记下细胞的荧光强度、标记效率、活性和增殖能力。结果:采用Ficoll梯密度离心法获得的hBMSCs,成骨、成脂分化染色阳性。不同浓度CM-Dil(5、10、20、30μmol/L)在30 min内均可成功标记hBMSCs,24 h后观察标记效率均达到98%以上(P>0.05)。直到20μmol/L的标记浓度对细胞的活力、增殖能力仍没有影响(P>0.05)。结论:CM-Dil是一种简便、安全的标记骨髓间充质干细胞的方法。

血清微环境对小鼠T细胞衰老的调节作用

目的:探讨血清微环境对小鼠T细胞衰老的调节作用。方法:分别取年老(12～14月龄)及年轻(1.5～2月龄)小鼠各10只,提取其脾脏淋巴细胞及血清,实验分4组。组I为年老鼠T淋巴细胞+10%年轻鼠血清;组II为年老鼠T淋巴细胞+10%年老鼠血清;组III为年轻鼠T淋巴细胞+10%年轻鼠血清;组IV为年轻鼠T淋巴细胞+10%年老鼠血清。培养48h后,经流式细胞术研究CD8+CD28+共表达率差异。结果:组I和组II T细胞表面的CD8+CD28+共表达率分别是(10.84±0.6841)%和(3.18±0.1789)%,组III和组IV T细胞表面的CD8+CD28+共表达分别是(12.5±0.9445)%和(8.36±0.2074)%。各组间对比有统计学差异(P<0.05)结论:血清微环境具有调节小鼠T细胞衰老的作用,年轻鼠血清能使年老鼠的T细胞表面的CD8+CD28+共表达率提高,年老鼠的血清能使年轻鼠的T细胞表面的CD8+CD28+共表达率降低。

胰岛素铁硒传递蛋白促进组织工程软骨形成的作用

目的研究胰岛素铁硒传递蛋白(ITS)对组织工程软骨形成的影响。方法第2代猪关节软骨细胞单层培养或离心形成细胞聚集体,根据培养液不同分为2组:常规培养组(达尔伯克改良伊格尔培养基+体积分数10%胎牛血清)和ITS组(达尔伯克改良伊格尔培养基+体积分数10%胎牛血清+体积分数1%ITS),噻唑蓝(MTT)法评估2组软骨细胞增殖;细胞聚集体培养1、2、3、4周后取材,比较2组细胞聚集体大体形态、湿质量、组织学、Ⅱ型胶原(ColⅡ)免疫组织化学染色和软骨特异基因表达。结果 MTT检测显示第5、6、7天ITS组光密度值显著高于常规培养组(P<0.01);ITS组软骨细胞聚集体体积在培养3周和4周时明显大于常规培养组;ITS组湿质量培养4周时为(7.91±1.49)mg,明显高于常规培养组的(5.37±1.31)mg(P<0.05)。ITS组细胞聚集体甲苯胺蓝染色和ColⅡ免疫组织化学染色明显强于常规培养组;2组软骨特异基因SRY相关高迁移组盒子基因9、ColⅡ表达相当,ITS组Ⅹ型胶原表达减弱,核心蛋白和Ⅰ型胶原表达增强。结论 ITS通过促进软骨细胞增殖和细胞外基质分泌可更好地促进组织工程软骨形成。

以ITS为主要成分的无血清培养基对软骨细胞增殖和表型的影响

目的观察以ITS为主要成分的无血清培养基对软骨细胞增殖和表型的影响。方法培养猪耳软骨细胞,分为无血清组和含血清组,无血清组应用包含胰岛素铁硒传递蛋白(ITS)、地塞米松及维生素C为主要成分的无血清培养基;含血清组应用包含10%血清的常规培养基。观察平面和三维培养状态下无血清培养基对软骨细胞增殖、基质分泌和软骨表型维持的作用。结果平面培养条件下,无血清组的细胞增殖率出现下调,细胞表型不能维持。在三维培养情况下无血清组可以保持软骨细胞存活和软骨细胞的表型,Ⅱ型胶原和蛋白多糖组织学染色结果与含血清组无明显差异,软骨特异基因ColⅡ、Aggrecan的表达与含血清组无明显差异,并能够形成较好的软骨样组织。结论以ITS、地塞米松及维生素C为主要成分的无血清培养基,在三维培养条件下能基本保持软骨细胞的存活和表型,可用于软骨细胞的体外三维培养。

基于人胚胎干细胞健康安全评价体系的构建

食品、药品、医疗器械和材料、生物制剂以及环境的质量和健康安全是政府和民众十分关注的热点问题。目前国际标准的健康安全评价检测方法以微生物、动物及其细胞作为载体,不能准确反映人类的生物学特征,预测人体心、肝等靶器官毒性及发育毒性的准确率偏低,在技术层面严重制约了人类健康安全的评价和监控。如何建立准确反映人类生物学特征的健康安全评价体系是关系国民健康安全的重大科学问题^（[1]）。

高浓度甲状腺素对软骨细胞聚集体(pellets)体外形成软骨组织的作用

目的：药物浓度（100nM）甲状腺素对组织工程软骨形成的作用。方法：将软骨细胞聚集体分为常规培养组（DMED＋10％FBS）和100nM甲状腺素组（DMED＋10％FBS＋100nM甲状腺素），体外培养1、2和3周取材进行大体形态、组织学、二型胶原和十型胶原免疫组化染色和软骨特异基因PCR分析。结果：100nM甲状腺素组形成的软骨细胞聚集体的体积和湿重均明显低于常规培养组，甲苯胺兰、二型胶原（C01II）染色较常规培养组弱，软骨细胞特异基因的表达水平与常规培养组相似，软骨细胞肥大相关基因十型胶原（ColX）及基质金属蛋白酶13（MMP13）的表达较对照组减弱，成骨方向分化相关基因（ColI，Runx2）的表达与常规培养组相似。结论：高浓度甲状腺素能够抑制软骨细胞肥大，但同时也抑制了软骨细胞增殖和软骨细胞基质分泌。

人胚胎干细胞分化为角质形成细胞过程中标志物的表达特点

目的:诱导人胚胎干细胞(human embryonic stem cells,h ESCs)定向分化为角质形成细胞K-h ESCs(keratinocyte derived from human embryonic stem cells),并分析诱导过程中K-h ESCs不同标志物的表达特点。方法:运用含骨形成蛋白4、维甲酸和N2添加剂的上皮分化培养基直接诱导h ESCs分化为K-h ESCs,通过染色体核型分析检测K-h ESCs核型,通过实时定量PCR检测K-h ESCs在分化的不同时期基因的表达及其与原代人牙龈上皮细胞(human gingival epithelial cells,HGECs)、人永生化口腔上皮细胞(human immortalized oral epithelial cells,HIOECs)、人永生化皮肤角质形成细胞Ha Ca T的基因表达差异;利用免疫组织化学检测不同标志物在K-h ESCs的蛋白表达。结果:运用上皮分化培养基成功地诱导h ESCs分化为上皮样细胞K-h ESCs;K-h ESCs核型具有正常46条染色体,无结构异常;K-h ESCs中角质形成细胞标志物基因p63的表达明显低于Ha Ca T细胞(P<0.05),而与HGECs和HIOECs中的表达差异无统计学意义(P>0.05)。结论:运用上皮分化培养基可成功诱导h ESCs分化为具有正常核型的Kh ESCs;标志物的表达特点提示诱导h ESCs分化为K-h ESCs的过程是从h ESCs向单层上皮干细胞分化继而转向复层上皮终末分化发展的趋势,最终得到的K-h ESCs类似于单层鳞状上皮干细胞向终末分化初始阶段的角质形成细胞,该阶段的细胞由上皮干细胞静止状态被激活,处于分化初始高增殖活力阶段。

特定序列寡核苷酸对人骨髓间充质干细胞增殖能力的影响

目的:比较不同种类特定序列寡核苷酸(Oligonucleotide,ODN)对人骨髓间充质干细胞(human bone marrow mesenchymal stem cells,hBMSCs)增殖能力的影响。方法:密度梯度离心法分离培养hBMSCs,传至第3代进行成骨、成脂及成软骨诱导,鉴定其多向分化能力;将hBMSCs以不同密度接种(3.0×103/cm2、6.0×103/cm2、1.2×104/cm2、2.4×104/cm2),采用CCK-8连续检测7d,确立最佳铺板密度;依据ODN种类(MT01、FC003、Sa05f)和终浓度(0.5mg/L、1.0mg/L、2.0mg/L、4.0mg/L)分为12个实验组和1个对照组(加等量PBS),采用CCK-8连续检测3d,明确不同种类及浓度的ODN对hBMSCs增殖能力的影响。结果:分离培养的hBMSCs具有成骨、成脂和成软骨的多向分化能力;以6.0×103/cm2的接种密度铺板可获得良好的细胞生长曲线;hBMSCs在加入每种不同浓度的ODN后,与对照组相比,终浓度为0.5mg/L的ODN FC003在第1天检测到光密度值显著升高(P<0.01);终浓度为1.0mg/L和4.0mg/L的ODN Sa05f在第1天检测到光密度值均显著降低(分别为P<0.01,P<0.05);终浓度为2.0mg/L的ODN MT01在连续3d内的光密度值均明显升高,差异具有统计学意义(第1天P<0.01,第2,3天P<0.05)。结论:终浓度为2.0mg/L的ODN MT01可显著促进hBMSCs的增殖。

应用细胞膜片复合硅胶管内支撑构建组织工程管状软骨

目的研究利用羊耳软骨细胞形成细胞膜片，构建无细胞支架组织工程管状软骨的可行性。方法体外培养扩增羊耳软骨细胞至第2代，以2．0×10^6cells／mL的高密度，培养7d，形成直径为35mm的圆形细胞膜片，将细胞膜片均匀包裹于硅胶管，植入裸鼠背部皮下，4周后取材检测。以大体观察、组织学、免疫组织化学等方法，对形成的软骨进行评价。结果大体观察可见形成良好的管状软骨，HE染色见软骨陷窝形态规则，番红0染色及Ⅱ型胶原免疫组化均呈阳性表达。结论细胞膜片复合硅胶管内支撑的方法能形成管状软骨，为气管软骨的再造提供了新的方法。