血液系统恶性疾病中肱址基因异常的生物学和临床研究进展

MLL儿基因定位于染色体11q23，是人类急性白血病染色体易位常累及的基因之一。MLL儿基因大约能和50多种不同的伙伴基因融合，形成的融合基因编码产生新的融合蛋白。MLL儿基因异常多见于淋巴系白血病、髓系白血病以及双表型白血病的患者，同时在婴幼儿患者和拓扑异构酶Ⅱ抑制剂引起的继发急性髓系白血病患者中也常常见到，这些患者多数预后不良。

参芪扶正注射液对急性髓系白血病患者调节性T细胞作用的体外研究

目的研究参芪扶正注射液对完全缓解期急性髓系白血病患者调节性T细胞的影响,探讨其调节免疫功能的机制。方法免疫磁珠法分离18例急性白血病患者的CD4+CD25+T细胞,并在IL-2作用下与不同浓度参芪扶正注射液共同培养,倒置显微镜下计数细胞,AnnexinⅤ法检测其凋亡率,酶联免疫吸附法检测其分泌IL-10的水平,逆转录聚合酶链式反应法检测参芪扶正注射液对CD4+CD25+T细胞表达FOXP3的影响。结果参芪扶正注射液对急性白血病患者CD4+CD25+T细胞的生长和凋亡率无明显影响。加入参芪扶正注射液后CD4+CD25+T细胞分泌IL-10明显减少,表达FOXP3的水平亦减少,且具有剂量依赖关系。结论参芪扶正注射液能作用于化疗后完全缓解白血病患者的调节性T细胞,通过减少其分泌IL-10及表达FOXP3的水平,从而抑制调节性T细胞的功能,减弱它对机体免疫的抑制作用,增强患者的免疫功能。

阿霉素纳米粒对白血病耐药细胞株K562/DOX耐药逆转作用的研究

目的 合成阿霉素聚氰基丙烯酸异丁酯纳米粒 ,观察其对阿霉素耐受性细胞株K5 6 2 (K5 6 2 /DOX)耐药性逆转效果并探讨可能机制。方法 采用乳液聚合法合成纳米粒 ,透射电镜观察计算粒径 ,分光光度法计算包封率 ;以梯度浓度的阿霉素纳米粒处理培养的K5 6 2 /DOX细胞 ,噻唑蓝比色法 (MTT)检测K5 6 2 /DOX细胞的半数生长抑制浓度 (IC50 )并计算逆转倍数 ;流式细胞术检测细胞内药物浓度 ;TUNEL法检测药物诱导后凋亡的发生及凋亡率。结果 阿霉素纳米粒平均粒径 (98 5± 3 7)nm ,包封率为 95 % ;MTT结果显示阿霉素纳米粒对K5 6 2 /DOX细胞的生长抑制率较单纯阿霉素显著增高 ,阿霉素纳米粒对K5 6 2 /DOX的耐药逆转倍数为 6 2 ;TUNEL检测经 10 μg/ml阿霉素纳米粒处理后的K5 6 2 /DOX平均凋亡率为 38 7%。结论 以聚氰基丙烯酸异丁酯纳米粒为载体的阿霉素可增强诱导K5 6 2 /DOX细胞凋亡的效率和有效逆转其耐药性。

急性混合细胞白血病临床特点及免疫学表型的研究

本研究目的是分析急性混合细胞白血病(MAL)的临床特点及生物学特征,临床疗效及预后。回顾性分析了48例MAL患者,这些患者均是根据国际白血病欧洲协作组(EGIL)1995年标准而诊断的急性混合细胞白血病;同时,以同期68例急性非淋巴细胞性白血病(AML)和61例急性淋巴细胞性白血病(ALL)患者作为对照。结果表明:在同期急性白血病500例中MAL发生率为9.6%,细胞形态上往往表现为AML以M1、M2亚型为主,ALL以L2亚型为主;MAL组白细胞中位数明显高于AML组和ALL组,差别有统计学意义(P<0.05),MAL组肝脾淋巴结肿大例数明显高于AML组(P<0.01),而与ALL组相比较差别无统计学意义(P>0.05);MAL组以髓系和B系抗原共表达为主,占70.9%,T系和髓系共同表达的占20.8%,T系、B系和髓系均表达的占8.3%;MAL组CD34阳性率为79.2%,明显高于AML组CD34阳性率(54.4%)和ALL组CD34阳性率(52.5%),差别均有统计学意义(P<0.01),提示MAL可能起源于造血干细胞;MAL组正常核型占32.1%,异常核型占67.9%,其中Ph染色体阳性率(25%)明显高于AML组Ph染色体阳性率(0%),差别有统计学意义(P<0.01),而与ALL组Ph染色体阳性率(16.7%)相比较差别无统计学意义(P>0.05);MAL组完全缓解率(CR率)为38.1%,明显低于AML组CR率(70.8%)和ALL组CR率(72.2%),差别均有统计学意义(P<0.01),MAL组疗效与CD34和Ph染色体的表达呈负相关。结论:MAL以髓系和淋巴系抗原共表达为主,它很可能源于造血干细胞,MAL较少见,常伴有较多的不良预后因素,缓解率低,预后差,因此须进一步探讨合理有效的治疗方案。

NF-κB抑制剂PDTC抗白血病细胞增殖的实验研究

目的:观察核转录因子NF-κB活性特异性抑制剂PDTC(吡咯烷二硫代氨基甲酸盐)对急性白血病细胞系K562细胞增殖的影响,并探讨其机制。方法:利用Trans AMTM NF-κB/p65活性测定试剂盒,检测PDTC作用K562细胞12h、24h后NF-κB亚基p65活性的变化;采用WST-1细胞增殖试验观察不同浓度PDTC作用24h、48h、72h对细胞增殖的影响;用单细胞凝胶电泳(彗星检测)方法检测PDTC对K562细胞DNA损伤的影响;利用免疫印迹法(Western blotting)检测PDTC对K562细胞中pro-caspase-3和活化型caspase-3蛋白表达的影响。结果:与对照组相比,经PDTC处理的实验组K562细胞NF-κB/P65的活性受到明显抑制(P<0.01);且PDTC能以时间和剂量依赖方式抑制K562细胞的增殖(P<0.05);单细胞凝胶电泳显示实验组细胞DNA受损,浓度为25μmol/L、50μmol/L、100μmol/LPDTC处理后,实验组细胞DNA总损伤细胞百分率分别为43.50%、84.00%、95.63%,明显高于对照组(9.75%),P<0.05,且存在明显的剂量依赖关系;Western blotting结果显示经PDTC处理后的K562细胞胞质中可检测到pro-caspase-3和活化型caspase-3蛋白的表达。结论:NF-κB参与白血病细胞的增殖与凋亡调控,PDTC抗肿瘤机制可能与抑制NF-κB活性,上调caspase-3表达,从而诱导细胞凋亡有关。

非亲缘异基因造血干细胞移植治疗白血病的临床研究

目的探讨非血缘关系异基因造血干细胞移植（URD-SCT）的疗效和相关并发症。方法22例白血病患者接受URD-SCT治疗。预处理方案：所有患者均采用马利兰联合环磷酰胺（BUCY2）或改良BUCY2预处理方案。移植物抗宿主病（GVHD）预防：22例均采用酶酚酸酯（MMF）＋环孢素A（CsA）＋短程甲氨蝶呤（MTX）方案，其中，4例用猪抗淋巴细胞球蛋白（ALG），16例于移植0d和移植后4d使用赛尼哌（CD25单抗），2例同时用ALG和CD25单抗。供者细胞回输：输注有核细胞中位数为4．5×10^8／kg，CD34^＋细胞中位数为4．3×10^6／kg。结果1例早期死亡不能评估，1例未植活，20例经血型、染色体及DNA多态性检测证实植活。急性Ⅱ～Ⅳ度GVHD8例；慢性GVHD8例：局限性3例，广泛性5例。感染：移植后100d内感染者17例，病原学确诊为细菌感染3例，真菌感染2例，巨细胞病毒（CMV）感染6例。存活情况：100d内死亡5例，100d后死亡5例，其余患者无病存活。结论进一步降低移植相关并发症已成为URD-SCT需解决的首要问题。对无血缘供者的高危白血病患者，在严格控制移植适应证情况下，URD-SCT仍是治疗的重要手段之一。

脐血移植治疗急性白血病的临床研究

目的 探讨同胞和非血缘关系脐血造血干细胞移植治疗急性白血病的疗效和相关并发症。方法 4例急性白血病患者分别行同胞和非血缘关系脐血移植各 2例。预处理方案 :以BUCY为基础化疗方案。移植物抗宿主病(GVHD)的预防 :采用环孢素A和短程甲氨喋呤方案。脐血细胞回输 :输注脐血有核细胞中位数为 3 5 5× 10 7/kg(2 2 0× 10 7～ 4 86× 10 7/kg) ,CD34+ 细胞中位数为 2 80× 10 5/kg (0 93× 10 5～ 3 85× 10 5/kg)。结果 4例患者脐血造血干细胞经DNA多态性分析证实植活。出现急性Ⅱ度和Ⅳ度GVHD各 1例 ,加强免疫抑制治疗后好转。 3例患者仍无病存活 ,生存时间分别为 36个月、 2 4个月、 2 0个月 ,1例患者移植后 7个月白血病复发。结论 脐血是造血干细胞的良好来源 ,脐血移植是治疗急性白血病的一种有效方法。

EGFP标记的hVEGF_(165)重组腺病毒构建新方法及其相关特性的体外研究

利用细菌内同源重组法快速构建增强型绿色荧光蛋白 (EGFP)标记的人血管内皮细胞生长因子 16 5(hVEGF165)重组腺病毒载体 ,并对其相关特性进行体外研究。首先将hVEGF165cDNA亚克隆到含EGFP基因的腺病毒穿梭质粒 pAdTrack CMV中 ,然后与腺病毒骨架质粒pAdEasy 1共同电击转化大肠杆菌BJ5183 ,同源重组获得重组腺病毒质粒 pAd EGFP/hVEGF165,鉴定后通过脂质体法转染HEK2 93细胞 ,产生重组腺病毒Ad EGFP/hVEGF165。通过体外试验观察病毒的形态、均一性和安全性 ,靶细胞的感染效率及hVEGF165的表达情况。结果显示 ,通过细菌内质粒间同源重组法在短期内成功地构建了复制缺陷型重组腺病毒载体Ad EGFP/hVEGF165;借助于EGFP的表达 ,直接在荧光显微镜下观测到靶细胞的感染效率和外源基因的表达。经纯化的病毒颗粒在电镜下成分均一 ,滴度可达 2× 10 12 pfu/ml。病毒感染Hela细胞后经多次传代未见细胞病变。以感染复数 (MOI) =10 0感染hUVEC可获得最大增殖刺激作用。同样浓度感染小鼠骨髓单个核细胞效率达 2 7.3% ,培养上清中hVEGF165蛋白含量达 1385± 332 pg/ 10 6cells。结论 :细菌内同源重组法构建腺病毒载体具有高效、省时、省力的特点 ,辅以EGFP为标记基因可以直观检测靶细胞感染和外源基因的表达情况。

正常妊娠妇女和妊娠期高血压疾病患者血浆TAFI和PAI-2变化的研究

目的:探讨凝血酶活化的纤维蛋白溶解抑制物(TAFI)和纤维酶原激活抑制物-2(PAI-2)在正常妊娠妇女和妊娠高血压疾病患者血浆中的变化及其临床意义。方法:研究对象包括22例妊娠期高血压疾病患者(其中子痫前期10例、妊娠期高血压12例)、30例正常妊娠妇女和30例正常未孕妇女,应用酶联免疫吸附试验(ELISA)测定研究对象妊娠早、中、晚三期血浆中的TAFI和PAI-2抗原水平。结果:与未孕对照组比较,正常妊娠组妊娠各期PAI-2均明显升高,差异均有显著统计学意义(P均<0.01),而TAFI在孕晚期才明显高于未孕组,差异有统计学意义(P<0.05),与正常妊娠组比较,妊娠期高血压组妊娠三期中TAFI、PAI-2抗原水平差异无统计学意义(P>0.05),子痫前期组妊娠三期TAFI明显高于正常妊娠组,而PAI-2均低于正常妊娠组,差异均具有统计学意义(P<0.05)。结论:TAFI、PAI-2在正常妊娠妇女发挥着纤溶抑制作用,维持母体凝血和纤溶的平衡。TAFI是一个预测子痫前期的敏感指标,有助于预测子痫前期患者血栓前状态的形成,而PAI-2不能用来判断母体内纤溶水平变化,但可能预示不良妊娠结局。两者对于妊娠期高血压患者的临床意义不大。

多种细胞因子与急性移植物抗宿主病发病关系的研究

目的：探讨异基因造血干细胞移植（allo-HSCT）患者不同时期血清细胞因子（CK）水平与急性移植物抗宿主病（aGVHD）严重程度的关系。方法：于移植前、移植后2、4、8、12周用流式微球技术监测17例allo—HSCT患者血清细胞因子（TNF-α、IFN-γ、IL-2、IL-4、IL-6及IL-10）水平的动态变化。结果：Ⅱ～Ⅳ度aGVHD患者组（5／17）与0～Ⅰ度aGVHD患者组（12／17）相比：移植后8、12周血清IFN-γ浓度（ng／L）前者较后者显著增高（13．66±1．16，14．10±0．42对比10．00±0．28，11．14±1．13）（P〈0．05）；移植后12周血清IL-6浓度（ng／L）前者较后者显著增高（10．17±1．07对比6．97±1.18，P〈0．05）；其余各时期细胞因子浓度对比无明显差异。结论：异基因造血干细胞移植后，发生Ⅱ～Ⅳ度aGVHD患者较0～1度aGVIID患者血清IFN-γ与IL-6浓度较高，为炎性免疫反应加重表现；TNF-α、IL-2、IL-4及IL-10水平两组间无品著差异，很可能受aGVHD严重程度、免疫抑制剂应用、免疫细胞功能恢复延迟等多因素影响。

半相合供者淋巴细胞输注抗急性非淋巴细胞性白血病的实验研究

目的 :阐明半相合供者淋巴细胞 (HRDLs)体外抗急性非淋巴细胞白血病 (ANLL)的机制。方法 :通过预实验 ,确定白血病细胞培养过程中加入HRDLs产生移植物抗白血病效应 (GVL)的最佳时间及最佳浓度 ,并在此条件下检测白血病细胞培养过程加入去CD8+ 和去CD4 + HRDLs后白血病细胞凋亡率及培养液中白细胞介素 2(IL 2 )浓度。结果 :在白血病细胞培养 2 4h(最佳时间 )后 ,加入浓度为 2 .5× 10 8/L(最佳浓度 )的去CD8+ HRDLs混合培养 ,其白血病细胞凋亡率 (17.0± 2 .5 ) %与对照组 (4 .4± 1.1) % (未加入HRDLs)及加入去CD4 + HRDLs组的白血病细胞凋亡率 (4 .8± 1.6 ) %相比较差异有统计学意义 ,但与加入未去CD8+ 和CD4 + HRDLs组的白血病细胞凋亡率 (17.4± 0 .6 ) %比较则差异无统计学意义。同时 ,去CD8+ HRDLs组培养液中IL 2浓度显著高于对照组和去CD4 + HRDLs组。结论 :CD4 + HRDLs在抗白血病效应中可能起着比CD8+ HRDLs更重要的作用 ,临床使用中 ,选择性去除CD8+ HRDLs,可以减少或减轻移植物抗宿主病 (GVHD) ,而不影响GVL效应 ,同时IL

Fas配体在髓系白血病细胞中的表达及功能研究

为了解Fas配体 (FasL)在髓系白血病细胞中的表达水平及其诱导Fas+敏感细胞发生凋亡的功能 ,用流式细胞术检测 38例髓系白血病患者 (外周血白细胞 >10 0× 10 9/L)的白血病细胞在新鲜分离及IL 2和IFN γ刺激后表面膜FasL的表达水平 ,将白血病细胞 ( 1× 10 6/ml)与Jurkat细胞 ( 1× 10 5/ml)混合培养 2 4小时后 ,用DNA电泳和流式细胞术双标法检测Jurkat细胞发生凋亡的情况。结果表明 :白血病细胞表面FasL表达量 ( 3.5 9± 1.0 5 ) %高于正常人 ( 0 .36± 0 .16 ) % ,P <0 .0 0 1,经IL 2和IFN γ刺激后其表达量明显增加 ( 7.78± 3.4 0 ) % ,P <0 .0 1;白血病细胞刺激前后诱导Jurkat细胞发生的凋亡率分别为 ( 8.2 8± 1.6 1) % ,( 10 .73± 2 .16 ) % ,差异具有显著性意义。结论 :FasL在髓系白血病细胞表面高表达且对Fas+的敏感细胞具有杀伤功能 ,推测Fas/FasL途径可能在白血病的“免疫逃逸”

血液肿瘤患者PICC置管术后出血与血小板计数相关性研究

目的探讨血液肿瘤患者PICC置管术后出血与血小板计数的关系。方法对76例血液肿瘤患者施行PICC置管,根据置管前、置管后1d血小板计数分为两组,血小板计数<20×109/L为实验组,血小板计数>20×109/L为对照组。比较两组患者置管后0h、1h、2h、24h的出血程度。结果两组不同时间出血程度比较,差异无统计学意义(均P>0.05)。结论血液肿瘤患者血小板计数<20×109/L行PICC置管未显著增加出血程度,PICC置管可作为减轻血液肿瘤患者反复穿刺疼痛及减少化疗药物外渗发生率的有效途径。

交叉表达淋系和髓系相关抗原的急性白血病的生物学及临床特征研究

目的 :探讨交叉表达淋系和髓系相关抗原的急性白血病患者的生物学与临床特征及预后。方法 :用流式细胞术检测白血病细胞的免疫表型 ,根据FAB亚型和免疫标记将病例分为 6组 :CD7表达阳性的急性髓细胞性白血病 (CD7+ AML)、CD7表达阴性的伴淋系相关抗原的急性髓细胞性白血病 (CD7-Ly+ AML)、不伴淋系相关抗原的急性髓细胞性白血病 (Ly-AML)、伴髓系相关抗原的急性淋巴细胞性白血病 (My+ ALL)、不伴髓系相关抗原的急性淋巴细胞性白血病 (My-ALL)和急性杂合性白血病 (HAL)。结果 :CD7+ AML组的白细胞数高于Ly-AML组及CD7-Ly+ AML组 ,诱导缓解率 (16 .7% )低于Ly-AML组 (71.4 % ) ,有显著差异 ;CD7-Ly+ AML组与Ly-AML组的临床特征无显著性差异。My+ ALL组与My-ALL组的临床特征无显著性差异。HAL组与My+ALL组和Ly+ AML组分别比较 ,发病年龄较高 ,白细胞数较高 ,贫血较明显 ,平均缓解期及平均生存期较短。结论 :CD7+ AML较之Ly-AML及CD7-Ly+ AML具有不同的临床特征 ,预后较差 ,可以看作一个独特的临床亚型。HAL与My+ ALL和Ly+ AML相比较 ,具有不同的临床特征 ,应该区别对待。

氯氧甲苯咪唑诱导白血病细胞凋亡的实验研究

为了研究氯氧甲苯咪唑(econazole)诱导鼠粒单核白血病细胞WEHI3凋亡的机制,利用AnnexinⅤ/PI双染实验测定细胞凋亡,Fura2荧光负荷技术检测细胞内游离钙离子浓度([Ca2+]i),并抽取WEHI3细胞内质网部分蛋白,利用Westernblot测定caspase7、caspase12的蛋白表达。结果显示:econazole作用后WEHI3出现典型的凋亡改变,细胞内游离[Ca2+]i较对照明显升高,caspase12和caspase7表达随着细胞内钙离子浓度的提高而逐渐增加。结论:econazole能诱导WEHI3细胞凋亡,caspase12在此过程中起重要作用。

Survivin在白血病细胞中的表达及GM-CSF对其影响的研究

本研究旨在探讨凋亡存活蛋白survivin在白血病的原代细胞和白血病细胞系中的表达情况,并观察粒-巨噬细胞细胞集落刺激因子(GM-CSF)对其的影响。用RT-PCR方法检测37例白血病患者、10例正常成人骨髓和3种白血病细胞系(K562、HL-60、U937)中survivin的表达。以HL-60细胞为对象,加入合适浓度的GM-CSF,用RT-PCR和Western blot分别检测加药前后surivin mRNA和蛋白水平的变化。结果显示:37例白血病患者中有25例表达survivin,阳性率为67.6%,其中急性淋巴细胞白血病(ALL)细胞中survivin mRNA表达阳性率为73.3%,高于急性髓系白血病(AML),但均高于正常对照组(20.0%)(P<0.05)。3种细胞系K562、HL-60和U937全部表达survivin。合适浓度的GM-CSF作用2天后,HL-60细胞中survivin的表达明显升高,其中mRNA水平升高了26%,蛋白水平升高了49%。结论:suvivin在白血病的原代细胞和细胞系中均有较高表达,而GM-CSF能显著提高HL-60细胞中survivin的水平。

血液肿瘤患者采用改良塞丁格技术留置PICC的可行性研究

目的探讨改良塞丁格穿刺方法行PICC置管术对血液肿瘤患者出血并发症的影响。方法将76例血液肿瘤行PICC置管患者分为观察组和对照组各38例,对照组采用传统穿刺方法置管,观察组采用改良塞丁格技术穿刺置管。结果两组置管过程均顺利。置管后24h观察组和对照组出血发生率分别为13.16%和10.53%,24h内非正常更换敷贴观察组为0.26次,对照组0.21次,两组比较,差异无统计学意义(均P>0.05)。结论对临床血液肿瘤患者采用改良塞丁格技术行PICC置管穿刺成功率高,安全可行。

CD40与慢性特发性血小板减少性紫癜免疫发病机制关系的初步研究

目的:了解慢性特发性血小板减少性紫癜(CITP)患者骨髓、血液中B淋巴细胞协同刺激因子CD40的表达情况,从而进一步了解CITP的免疫学发病机制。方法:采用流式细胞术检测CITP患者的骨髓及末梢血的淋巴细胞协同刺激因子CD40的表达,并用ELISA方法检测血液中的PAIgG。结果:CITP组末梢血B淋巴细胞CD40表达率(13.81%±2.98%)明显高于正常对照组(6.31%±1.24%),两者比较差异有统计学意义(P<0.01);CITP组骨髓B淋巴细胞CD40表达率(23.65%±3.25%)也明显高于正常对照组(8.32%±2.34%),两者比较差异亦有统计学意义(P<0.01);CITP患者的外周血B淋巴细胞CD40表达率与PAIgG水平两者间呈显著的正相关(r=0.92,P<0.05)。结论:CD40在CITP患者淋巴细胞的表达异常增高,可能是CITP发病的免疫学机制之一。

DVCLP方案联用粒细胞集落刺激因子对成人急性淋巴细胞白血病诱导缓解治疗的临床研究

目的研究粒细胞集落刺激因子(G-CSF)与DVCLP方案联用治疗初治成人急性淋巴细胞白血病(ALL)的疗效。方法40例患者接受DVCLP方案诱导化疗。随机分为两组:试验组(20例)在化疗前3天至化疗的第7天给予G-CSF;对照组(20例)则在化疗时ANC<1.5×109/L中给予G-CSF。结果患者ANC<1.5×109/L的天数试验组要明显短于对照组[16天±7天,21天±5天(P<0.05)]。完全缓解率、复发率、生存中位数时间、一年生存率试验组依次为85%、22%、11个月、45%;对照组依次为75%、55%、6个月、19%(P>0.05)。结论成人ALL诱导化疗早期应用G-CSF可明显缩短粒细胞减少时间,但对提高完全缓解率、减少复发率和改善长期生存的影响未达到统计学差异。