医学院校实验动物中心生物安全的综合管理

医学院校的生物安全一直是实验动物中心工作的重要内容之一,规范的管理、传染源的控制是生物安全防控的关键。徐州医科大学实验动物中心在动物实验室管理和实验动物病原防控中,建立了完善的管理体系,保障了实验动物质量的合格,杜绝了突发的生物安全事件,从而为全校的科学研究提供了优良的公共服务平台。

浅谈医学研究生实验动物教学

实验动物学是生命科学研究领域中一门重要的基础课程,是研究生实验动物科研水平的基础保障。由于研究生背景知识的差异,实验动物相关知识水平差异明显,对于实验动物技术相关知识的需求不同,因此教授该课程需要一定的系统性、包容性和实用性。本文从教学内容、教学方法、教学效果评价等几个方面对研究生实验动物教学进行了深入地探讨。

实验动物伦理教育与3R原则在医学院校实施情况的探究

实验动物在生命科学和医学的进步及发展过程中起到重要的推动作用。该文回顾了实验动物伦理和3R原则的发展,阐述了实验动物伦理教育的必要性。在分析了当前医学院校实验动物伦理教育现状的情况下,提出了医学院校应该通过增加实验动物伦理方面相关课程,强化学生实验教学动手能力,多途径宣传实验动物伦理知识,培训实验指导教师以身作则等方法和手段,提高医学生对待实验动物的态度和观点,激发医学生对生命的尊敬和爱护,培养医学生良好的医德和人文精神。

山东、广西地区新型鹅细小病毒全基因组扩增及遗传进化分析

为监测新型鹅细小病毒(Novel goose parvovirus,NGPV)的流行和变异情况,研究采集了山东和广西部分地区的鸭短喙综合征病料进行病原检测、全基因组扩增及序列比对分析。结果显示:共分离两株NGPV,山东分离株命名为SD202304,广西分离株命名为GX202304,两株病毒与2021年NGPV分离株HNXY21亲缘关系最近,全基因组序列相似性为99.1%;GX202304株末端重复序列(Inverted terminal repeat,ITR)有一段未见报道的51 bp基因插入;VP3编码氨基酸序列比对显示,在第290位GX202304株和SD202304株有一个苏氨酸到丙氨酸的突变,这是NGPV近年来发生的新变异位点。研究表明,从山东、广西地区分离到的两株NGPV存在51 bp新的基因插入片段和VP3新的突变位点,结果为我国NGPV感染的防控提供科学依据。

新型鹅细小病毒病诊断及其综合防治措施

由新型鹅细小病毒(Novel goose parvovirus,NGPV)引起的鸭短喙与侏儒综合征(Short beak and dwarfism syndrome,SBDS)可导致鸭的“大舌病”,常出现胫骨骨折、生长发育受阻、体重减轻等症状,给我国养鸭业造成严重的经济损失。NGPV主要感染樱桃谷鸭、北京鸭、番鸭和半番鸭等。本文就NGPV病的病因分析、流行病特点、临床症状和免疫防控进行综述,以期为该病的防治提供参考依据。

纳米顺铂对小鼠卵母细胞体外成熟的影响

纳米顺铂通过纳米载体包载顺铂进而发挥抗肿瘤作用,但纳米顺铂在杀死肿瘤细胞的同时,其对动物生殖细胞的影响尚不明确,试验通过在卵母细胞成熟培养液中添加顺铂及纳米顺铂对比了二者对小鼠卵母细胞体外成熟的影响。采集ICR小鼠未成熟卵母细胞并随机分为对照组、顺铂组和纳米顺铂组,体外培养16 h后统计卵母细胞成熟率;并对比卵丘卵母细胞复合体和裸卵经顺铂和纳米顺铂处理后减数分裂进程的差异,以探究颗粒细胞对纳米顺铂影响卵母细胞减数分裂的作用。通过免疫荧光染色检测染色体、纺锤体及肌动蛋白帽的形态变化以确定纳米顺铂对卵母细胞体外成熟过程中细胞骨架的影响。结果显示,顺铂组卵母细胞成熟率显著低于对照组,纳米顺铂组卵母细胞成熟率显著高于高浓度顺铂组,去除颗粒细胞后,纳米顺铂组停滞于GV期卵母细胞比例显著低于高浓度顺铂组。与对照组相比,顺铂组和纳米顺铂组的染色体排列正常率和细胞骨架形态正常率均显著降低,但纳米顺铂组染色体排列正常率显著高于顺铂组,两组之间细胞骨架正常率无显著性差异。结果提示,纳米顺铂通过增加减数分裂的完成性及维持核染色体的正常排布来减弱对小鼠卵母细胞的毒性作用,但不能改善顺铂对卵母细胞骨架的损伤,颗粒细胞能够在一定程度上降低纳米顺铂对卵母细胞减数分裂恢复的抑制作用。

雷夫尼特诱导非小细胞肺癌铁死亡

目的探究雷夫尼特诱导非小细胞肺癌(NSCLC)铁死亡的机制。方法将A549细胞分为4组:对照组及7.5、15、30μmol/L雷夫尼特组。雷夫尼特处理组采用相应浓度的雷夫尼特处理24 h,对照组采用DMSO处理。采用RNA测序法分析雷夫尼特处理后A549细胞基因变化,KEGG途径富集分析筛选雷夫尼特抑制NSCLC的可能通路。采用实时定量PCR和Western blot在mRNA和蛋白质水平验证雷夫尼特处理后铁死亡途径相关蛋白的变化。采用试剂盒检测雷夫尼特处理后细胞氧化应激水平的变化。结果KEGG途径富集分析表明,失调基因主要参与补体和凝血级联、抗坏血酸和醛糖代谢、铁死亡等途径,其中铁死亡途径相关基因有23个。雷夫尼特处理后,GPX4、SLC7A11、SLC40A1基因mRNA表达较对照组显著下调(P<0.05),ACSL4、HOMX1基因mRNA表达显著上调(P<0.05)。此外,GPX4、SLC40A1、FTH1蛋白表达量显著降低(P<0.05),ACSL4蛋白表达量显著上升(P<0.05)。氧化应激指标超氧化物歧化酶(SOD)活性和还原型谷胱甘肽(GSH)含量较对照组显著下降(P<0.05),丙二醛(MDA)含量显著增高(P<0.05)。结论雷夫尼特可能通过铁死亡途径参与调节NSCLC。

稳定表达小鹅瘟病毒VP3基因的293T细胞系构建

为构建稳定表达鹅细小病毒(goose parvovirus,GPV)VP3基因的293T细胞系,利用PCR技术扩增GPV的VP3基因,构建真核表达质粒pcDNA3.1-GPV-VP3,再将其转染至293T细胞,并利用博来霉素(zeocine)进行药物压力筛选。结果表明,获得的293T细胞系能够高效表达VP3蛋白,这为小鹅瘟病毒VP3蛋白的生物学功能的深入研究以及鹅细小病毒抗体检测方法的建立提供良好的生物材料。

梨状皮层注射红藻氨酸建立癫痫小鼠模型

目的:建立和评价梨状皮层微量注射红藻氨酸(kainic acid,KA)激发的癫痫小鼠模型。方法:利用即刻早期基因(c-fos)免疫荧光染色技术、原位末端转移酶标记染色(TdT-mediated dUTP nick-end labeling,TUNEL)技术在急性癫痫小鼠模型中确定癫痫相关脑区梨状皮层。在梨状皮层脑立体定位注射KA后,观察小鼠癫痫发作程度(Racine评分)和癫痫发作潜伏期,行为学实验包括水迷宫检测小鼠学习记忆能力和新物体识别实验检测小鼠探索能力,癫痫发作结果和行为学实验结果均与海马立体定位注射KA的癫痫模型作对比。利用电生理技术检测新模型小鼠神经元电活动。结果:c-fos免疫荧光和TUNEL染色结果显示,在急性癫痫小鼠模型中除海马外,梨状皮层脑区神经元也被大量激活,且发生凋亡;在梨状皮层注射KA后成功激发癫痫,与海马注射KA的癫痫模型相比,癫痫发作评分没有显著性差异且发作潜伏期更短;行为学结果显示,梨状皮层注射KA的癫痫模型小鼠空间记忆能力降低,新物体探索能力降低,该结果与海马注射KA的癫痫模型相比无显著性差异;膜片钳实验显示梨状皮层注射KA的癫痫模型神经元放电频率增加、幅值降低、静息膜电位上升。结论:在梨状皮层微量注射KA后成功激发癫痫,这为癫痫发病机制的研究提供了一种新的动物模型。

TM6SF1基因在肺腺癌细胞中的作用

目的:探讨TM6SF1基因在肺腺癌细胞中的作用。方法:通过GEPIA数据库分析TM6SF1基因在肺腺癌及正常组织中的表达情况;细胞增殖实验检测过表达TM6SF1后,A549细胞的增殖情况;细胞划痕实验检测过表达TM6SF1后,A549细胞伤口愈合情况;Transwell细胞实验检测过表达TM6SF1后,A549细胞侵袭和迁移情况。结果:通过GEPIA数据库分析得知,与正常组织相比,TM6SF1在肺腺癌中的表达降低,差异有统计学意义(^(*)P<0.05,^(**)P<0.01,^(***)P<0.001),且高表达TM6SF1组生存期更长。另外,TM6SF1与细胞增殖相关的核抗原Ki-67具有负相关性。过表达TM6SF1后,A549细胞的增殖,侵袭和迁移都受到抑制,差异有统计学意义(^(*)P<0.05,^(**)P<0.01,^(***)P<0.001),且下调细胞中信号(PI3K/Akt)通路相关激酶的表达。结论:TM6SF1基因在肺腺癌中可能作为抑癌因子。

外源性胰岛素样生长因子-1对老年小鼠认知功能的影响

目的探讨胰岛素样生长因子-1(IGF-1)对老年小鼠认知功能的影响机制。方法给予老年C57/BL6小鼠侧脑室注射IGF-1,Western blot检测胰岛素样生长因子-1受体(IGF-1R)蛋白的表达,5-溴脱氧尿嘧啶核苷(Brd U)荧光染色标记海马齿状回增殖的细胞,尼氏染色标记海马齿状回神经元,用Morris水迷宫实验和跳台实验评定老年小鼠学习记忆能力。结果 Western blot检测显示,IGF-1组老年小鼠海马中IGF-1R表达与对照组比较,差异有统计学意义(P<0.05)。Brd U染色结果显示,IGF-1组海马Brd U阳性细胞数与对照组比较,差异有统计学意义(P<0.05)。尼氏染色结果显示,IGF-1组神经元细胞数与对照组比较,差异有统计学意义(P<0.05)。水迷宫实验结果显示,经过训练后,IGF-1组老年小鼠的逃避潜伏期短于对照组,穿过平台的次数与对照组比较,差异有统计学意义(P<0.05)。跳台实验结果显示,与对照组比较,IGF-1组老年小鼠的基础错误次数减少,而潜伏期延长(P<0.05)。结论老年小鼠注射IGF-1后,其认知功能有一定改善,IGF-1可以提高老年小鼠认知功能。

兔病毒血症RT-PCR检测方法的建立及初步应用

根据GenBank上公布的RHDVvp60基因保守序列，设计引物，以RHDV发病兔的肝脏为材料，提取总RNA，RT—PCR扩增出大小为368bp的目的基因片段。该方法检测RHDV具有特异性，敏感性为血凝试验（HA）的3．2×10^3倍。通过对健康免疫兔的82份鼻拭子样品进行检测，阳性样品为14份，阳性率为17．07％。试验结果表明，RT-PCR方法能快速、敏感地从健康免疫兔鼻拭子样品中检出RHDV。

银杏内酯A对大鼠全脑缺血／再灌注损伤的影响及其机制研究

目的探讨银杏内酯A对全脑缺血／再灌注大鼠脑组织损伤的保护作用及其相关机制。方法采用四动脉结扎法构建大鼠全脑缺血／再灌注模型。将大鼠随机分为假手术组（sham组）、缺血／再灌注组（I／R组）和缺血／再灌注给药组（GA组）。观察银杏内酯A对各组大鼠神经功能缺损评分（NDS）、脑梗死面积、脑组织内超氧化物歧化酶（SOD）活力及丙二醛（MDA）含量的影响。结果全脑缺血／再灌注6h后，银杏内酯A能明显降低大鼠NDS分值，减少脑梗死面积，降低脑组织内MDA含量，同时提高SOD活性。结论银杏内酯A能显著改善大鼠全脑缺血／再灌注后的脑神经功能，减轻缺血／再灌注对大鼠脑组织的损害，具有一定的脑保护作用。

GST-CBX2-1融合蛋白表达载体的构建及其在原核细胞中的表达

目的:构建GST标签的CBX2-1融合蛋白表达载体,并在大肠杆菌中诱导表达,纯化出表达蛋白。方法:以CBX2-1全长为模板,构建3对引物,将CBX2-1PCR扩增成3段,通过XhoⅠ和NotⅠ酶切位点将其定向插入p GEX-4T-3载体中,并转化E.coli DH5ɑ,通过限制性内切酶酶切电泳和DNA测序坚定正确后,转入E.coli BL21中,经IPTG大量诱导表达,SDSPAGE电泳和Western blot鉴定,运用GST pull down方法纯化3段蛋白。结果:酶切电泳及测序结果证明,原核表达质粒GST-CBX2-1 3个载体构建成功,用Western blot方法证实了GST-CBX2-1-1(1-288),GST-CBX2-1-2(259-600),GST-CBX2-1-3(601-1596)融合蛋白的表达,并成功纯化出3段蛋白。结论:成功构建了GST-CBX2-1-1,GST-CBX2-1-2,GST-CBX2-1-3原核表达载体,证实了其在原核细胞大肠埃希菌中的表达与纯化,为进一步研究CBX2-1各结构域的功能提供了前提基础。

兔病毒性出血症3C基因荧光表达载体的构建及其在293 T细胞中的表达

目的：构建EGFP与3C融合表达的真核表达质粒，为研究RHDV 3C蛋白在病毒感染中的作用提供基础。方法 RHDV 3C基因的片段经过反转录成cDNA，纯化的PCR产物经EcoRⅠ和SalⅠ双酶切后克隆到pEG-FP－C1载体，构建EGFP与3C融合表达的真核表达质粒。 pEGFP－C1－3C真核表达载体转染293T细胞，24 h后荧光显微镜检测及Western blot检测EGFP－3C融合蛋白表达情况。结果24 h后荧光显微镜及Western blot检测表明RHDV 3 C基因全长编码序能够成功插入到pEGFP－C1载体。结论 EGFP－3 C融合表达质粒能够被成功构建，从而有助于探索RHDV 3C蛋白在RHDV感染过程中的功能，为深入探讨RHDV的防治提供基础。

SNCA和GBA在帕金森病中相互作用研究进展

帕金森病(PD)是神经系统退行性疾病,病因和发病机制尚不清楚。PD相关基因(如SNCA、GBA、LRRK2、SCARB2、LAMP3、RAB29/RAB7L1、MAPT、GAK、SREBF1和GPNMB等)突变增加散发性PD罹患率。α-突触核蛋白基因SNCA和β-葡萄糖脑苷脂酶基因GBA突变是PD遗传危险因素,但二者在PD中的相关性还有待阐明。

细胞自噬促进脂肪干细胞向软骨细胞分化

目的:探讨细胞自噬对ADSCs分化的影响。方法:无菌条件下取大鼠大网膜,肾周脂肪囊,睾丸周围等处取脂肪组织并分离ADSCs,用软骨细胞诱导培养基进行培养,并通过抑制剂或干扰分子改变细胞自噬水平,检测ADSCs向软骨细胞分化的变化情况。结果:抑制自噬,细胞表达软骨细胞标识蛋白,SOX-9的量显著下调:诱导自噬,SOX-9的表达显著升高,结论:细胞自噬促进ADSCs向软骨细胞分化。

雷帕霉素通过诱导细胞自噬调控调节性T细胞的分化及功能

目的探究雷帕霉素Treg细胞的调控作用是否与细胞自噬有关。方法取小鼠脾脏,经研磨后用细胞分选试剂盒分选细胞。细胞经抑制剂或干扰分子处理改变细胞自噬水平。通过流式细胞术检测Treg细胞的生成比例。结果抑制自噬Treg细胞生成比例显著下降。结论细胞自噬参与调控Treg细胞功能。

姜黄素减轻小鼠癫痫发作

目的探讨姜黄素对小鼠癫痫发作的作用及机制。方法C57/BL6雄性小鼠60只,随机分为3组:正常组、癫痫模型组和姜黄素治疗组,每组20只。观察记录每组小鼠癫痫发作Racine分级评分和癫痫发作的潜伏期。免疫荧光染色检测海马CA3区GFAP和IBA-1表达,蛋白免疫印迹(Western blot)检测海马IL-1β、NLRP3、caspase1的表达水平。结果姜黄素治疗组小鼠癫痫发作Racine分级评分显著低于癫痫模型组(P<0.05),发作潜伏期显著延长(P<0.05)。与正常组相比,模型组海马CA3区GFAP和IBA-1的表达显著增加(P<0.01),胶质细胞呈现明显激活状态,IL-1β、NLRP3、caspase1蛋白的相对表达量显著升高(P<0.01),与模型组相比,姜黄素组海马CA3区的GFAP和IBA-1阳性细胞数显著减少(P<0.05),海马IL-1β、NLRP3、caspase1蛋白相对表达量也显著降低(P<0.05)。结论姜黄素可以减轻癫痫发作程度,这可能通过调节NLRP3/caspase1通路抑制海马炎性反应来实现。

CBX2-1与p53相互作用的机制

目的:检测CBX2-1与p53是否存在相互作用,并一步检测CBX2-1与p53发生相互作用的结构域。方法:在大肠杆菌中表达GST-CBX2-1融合蛋白,GST pull down纯化出蛋白与细胞裂解液混合,Western blot检测两个蛋白相互作用。同样的方法进一步检测CBX2-1与p53发生相互作用的结构域。结果:Western blot结果显示CBX2-1与p53存在直接相互作用,相互作用的结构域是CBX2-1蛋白N端1-288肽段和259-600肽段及p53蛋白的98-292肽段。结论:CBX2-1蛋白通过N端1-288肽段和259-600肽段与p53蛋白98-292肽段相互作用,为进一步研究研究CBX2-1参与神经性列腺癌的机制提供了一定的理论基础。