基于液相色谱-质谱联用技术的肺癌细胞代谢组学分析

通过高效液相色谱-四极杆飞行时间质谱(HPLC-Q-TOF/MS)分别对肺癌细胞与正常细胞的极性与非极性代谢物进行指纹图谱分析,进一步应用偏最小二乘判别分析(PLS-DA)对代谢组学数据进行多维统计分析。研究结果显示,与正常细胞相比,肿瘤细胞存在异常的蛋白质、脂肪酸、磷脂代谢,并发现31种对分类有显著贡献的代谢小分子物质。通过本研究,建立了基于液相色谱-质谱联用技术的肺癌细胞代谢组学分析方法,发现了肺癌潜在疾病标记物,可为肺癌分子标记物的发现及其早期诊断提供新思路和新方法。

桔梗皂苷D联合伊马替尼对K562细胞的增殖抑制作用及机制研究

目的探讨桔梗皂甙D(platycodin,PD)与伊马替尼(imatinib,IM)联合用药抑制慢性粒细胞白血病细胞株K562的作用及机制研究。方法体外培养CML细胞株K562,CCK-8测定PD和IM单药及联合用药对K562细胞增殖的抑制作用;流式细胞仪检测Annexin V/PI标记的细胞凋亡率,Western blot方法检测cleaved caspase-3、cleaved caspase-9、PARP、cleaved PARP、Bcr/abl、p-AKT、p-m TOR蛋白表达。结果联合用药组对K562细胞的增殖抑制作用和诱导细胞凋亡率较单独用药组效果明显,差异均有统计学意义(均P<0.01)。与单药组比较,联合用药组可以明显上调cleaved caspase-3、cleaved caspase-9、cleaved PARP蛋白表达,同时下调PARP、Bcr/abl、p-AKT、p-m TOR蛋白的表达,差异均有统计学意义(P<0.01或0.05)。结论 PD与IM联合用药在抑制细胞增殖、诱导凋亡、抑制Bcr/abl蛋白和PI3K/AKT/m TOR信号通路方面明显优于单独用药。

隐丹参酮通过miR-124靶向调控PKM2基因表达抑制胃癌细胞的增殖和转移

目的:研究隐丹参酮对胃癌细胞增殖和转移的作用,并探讨miR-124在其中的潜在机制。方法:体外培养人胃癌MKN-49P细胞,给予不同浓度隐丹参酮处理。采用CCK-8法检测各组胃癌细胞增殖能力的变化;划痕实验对MKN-49P细胞迁移能力进行评估。采用荧光实时定量PCR(qRT-PCR)方法检测MKN-49P细胞miR-124、PKM2 mRNA的表达;Western blot及间接免疫荧光检测其靶基因PKM2蛋白的表达。结果:与空白组比较,隐丹参酮10、20μmol/L组MKN-49P细胞的增殖及迁移能力显著降低,miR-124表达显著升高,PKM2 mRNA及蛋白表达显著降低(P<0.05)。结论:隐丹参酮通过miR-124靶向抑制PKM2基因的转录表达,进而抑制胃癌细胞的增殖和转移,其作用呈浓度和时间依赖性。

藤黄酸诱导肺癌细胞H1975凋亡的机制研究

目的研究藤黄酸(GA)诱导人肺癌细胞H1975凋亡的分子机制,探讨氧自由基(ROS)和JNK信号通路在GA杀伤肺癌细胞中的作用。方法以人肺癌细胞H1975为研究对象,MTT法测定GA抑制细胞增殖的作用,Arnexin V/PI双染法测定细胞凋亡率,DCFH-DA法测定ROS含量,JC-1探针染色分析线粒体膜电位(MMP),Westerrn blot检测JNK信号通路的激活和线粒体凋亡途径相关蛋白表达的变化。结果GA呈剂量依赖性抑制H1975细胞的增殖,各实验组细胞存活率与空白对照组比较,均有统计学差异(P<0.05或0.01)。1、2.5和5μmol/L GA作用24h后,细胞凋亡率分别为25.2%、51.8%和75.1%,剪切型凋亡相关蛋白cleaved caspase-9、cleaved caspase-3和cleaved PARP的表达随GA浓度增高而显著增加,与空白对照组比较,均有统计学差异(P<0.05或0.01)。GA作用2h后H1 975细胞ROS含量显著升高,磷酸化、JNK(p-、JNK)表达上调(P<0.05或0.01)。GA作用16h后各实验组细胞MMP均明显降低(均P<0.05)。GA作用24h后实验组细胞线粒体凋亡途径相关蛋白Bax、Bak、Bik表达增加,而抗凋亡蛋白Bcl-2表达与空白对照组相比明显下降(P<0.05或0.01)。结论 GA具有诱导H1975细胞凋亡的作用,其可能机制是上调细胞内ROS含量,激活JNK信号通路,进而引起MMP降低和线粒体凋亡途径激活。

隐丹参酮调控Wnt/β-catenin信号通路对胃癌细胞抑制作用的研究

目的:探究隐丹参酮调控Wnt/β-连环蛋白(β-catenin)信号通路对胃癌细胞的抑制作用。方法:将人胃癌BGC-823细胞株分为对照组,隐丹参酮低、中、高剂量组(以下简称低、中、高剂量组),高剂量+SKL2001组,高剂量+XAV939组。低、中、高剂量组在培养过程中加入20、40、80μmol/L的隐丹参酮;高剂量+SKL2001组中加入80μmol/L隐丹参酮与20μmol/L SKL2001;高剂量+XAV939组中加入80μmol/L的隐丹参酮与1μmol/L的XAV939。采用MTT法、Transwell小室法、细胞划痕实验分别检测细胞的增殖能力及迁移侵袭能力。采用RT-PCR与蛋白免疫印迹法检测细胞中蓬乱蛋白DSH同源物2(Dvl2)、糖原合成酶激酶-3 (GSK-3β)、β-catenin和G1/S-特异性周期蛋白-D1 (Cyclin D1)表达水平。结果:与对照组比较,低、中、高剂量组处理24 h、48 h、72 h后细胞增殖抑制率、GSK-3β蛋白及mRNA表达上升(P<0.05),Dvl2、β-catenin、Cyclin D1蛋白及mRNA表达降低(P<0.05),且呈剂量依赖性(P<0.05)。细胞划痕48 h后,低、中、高剂量组细胞迁移能力、过膜细胞数及划痕愈合率均降低(P<0.05),且随着剂量增加而降低(P<0.05);与高剂量组比较,高剂量+SKL2001组迁移能力、过膜细胞数及划痕愈合率均增高(P<0.05);与高剂量+SKL2001组比较,高剂量+XAV939组迁移能力、过膜细胞数及划痕愈合率均降低(P<0.05)。结论:隐丹参酮能通过抑制Wnt/β-catenin信号通路的活性对胃癌细胞起抑制作用。

隐丹参酮抗肺腺癌作用的研究

目的探讨隐丹参酮(CPT)对人肺腺癌细胞株A549和PC-9诱导凋亡的作用及其可能机制。方法不同浓度的CPT分别作用A549和PC-9细胞24和48h,CCK-8法检测细胞存活率,Annexin V-FITC/PI流式细胞术检测细胞凋亡,JC-1染色流式细胞术检测线粒体膜电位的变化,Western blot法检测凋亡相关蛋白cleaved Caspase-9、cleaved Caspase-3、聚腺苷酸二磷酸核糖转移酶(PARP)和信号转导及转录激活因子3(STAT3)信号通路相关蛋白磷酸化STAT3(p-STAT3)蛋白的表达水平。结果 CPT能够抑制A549和PC-9细胞的增殖,且呈剂量和时间依赖性。CPT作用于A549和PC-9细胞24h后,细胞凋亡率随CPT浓度增加呈增长趋势,而线粒体膜电位降低。CPT作用于A549和PC-9细胞后cleaved Caspase-9、cleaved Caspase-3和cleaved PARP蛋白表达水平增加,p-STAT3蛋白表达水平下降。结论 CPT对人肺腺癌细胞A549和PC-9有显著的增殖抑制作用和诱导凋亡效应,线粒体凋亡途径和STAT3信号通路可能参与了这一过程。

超声介导靶向微泡治疗脑梗死白兔动物实验研究

目的探究采用超声介导靶向微泡[自制,含造影剂(全氟显)、血管内皮生长因子_(165)c脱氧核糖核酸(VEGF_(165)c DNA)、抗细胞间粘附因子(ICAM-1)单克隆抗体]治疗脑梗死白兔的动物实验效果,同时观察VEGF_(165)c DNA基因转染对改善受损血管内膜的作用。方法选取60只新西兰大白兔,通过高脂饮食制作脑梗死模型,随机分为3组,分别采用超声介导靶向微泡(A组)、爱通立(B组)、生理盐水(对照组)进行治疗,观察各组白兔治疗后血管再通情况、梗死部位坏死区中性粒细胞浸润情况、梗死区质量比重。结果治疗后A组及B组血管再通情况优于对照组(P<0.05),但A组与B组血管再通情况比较差异无统计学意义(P>0.05);治疗后A组梗死部位坏死区中性粒细胞平均计数明显少于B组及对照组(P<0.05),但B组与对照组梗死部位坏死区中性粒细胞平均计数对比差异无统计学意义(P>0.05);治疗后A组梗死区质量占比低于B组及对照组(P<0.05),且B组梗死区质量占比低于对照组(P<0.05)。结论超声联合靶向微泡介导脑梗死治疗的动物实验VEGF_(165)c DNA基因转染治疗效果较好,能改善血管再通情况,减轻梗死区域的炎性反应,减少梗死区质量占比,有利于治疗脑梗死。

牛茄子叶绿体全基因组特征及系统发育分析

目的以牛茄子Solanum capsicoides新鲜叶片为材料,对叶绿体基因组序列进行组装、注释和分析,探究牛茄子的序列特征和同属其他物种的系统发育关系。方法基于Illumina HiSeq高通量测序,获得牛茄子完整叶绿体基因组序列,利用生物信息学方法进一步对其功能及特征、密码子偏好性、IR区域边界、核苷酸多样性、系统发育关系进行分析。结果牛茄子叶绿体基因组全长为155465 bp,为典型的四分体结构,总GC含量为37.85%,其中大单拷贝区、小单拷贝区和反向重复序列的长度分别为88265、18462、24369 bp;共编码131个基因,包括86个蛋白编码基因、37个tRNA基因、8个rRNA基因。简单重复序列检测表明,叶绿体基因组包括51个SSR位点,其中以A和T组成的单核苷酸重复次数最多,占45.1%。密码子偏好性分析表明,亮氨酸是使用频率最高的氨基酸,AUU是使用次数最多的密码子,密码子偏向使用A/U结尾。属内叶绿体基因组比较分析显示,IR边界区域相对保守,但仍存在部分基因扩张和收缩等现象;核苷酸多样性分析获得了4个高突变热点:trnQ-psbK、psbF-psbE、clpP、ycf1,可作为物种鉴定和遗传多样性研究的潜在特征。系统发育分析显示牛茄子和喀西茄的亲缘关系更近,存在姐妹关系。结论牛茄子叶绿体基因组的组装和系统发育分析,为茄属植物的分类和群体间遗传多样性的研究提供理论依据。

雷公藤多苷对溃疡性结肠炎大鼠模型炎症及TLR4／MyD88信号通路的作用

目的观察雷公藤多苷（TWP）对溃疡性结肠炎（UC）的作用，以及对Toll样受体4（TLR4）／髓样分化因子88（MyD88）信号通路的干预作用，以探讨其可能的作用机制。方法采用三硝基苯磺酸（TNBS）／乙醇灌肠法建立UC大鼠模型。采用随机数字表法将90只雄性Wistar大鼠随机分为正常对照组、模型对照组及TWP低、中、高剂量（3、6、12mg／kg）组、硫唑嘌呤（AZA）组（6mg／kg），每组15只。造模后第4天，各组分别给予相应药物连续灌胃14d。观察各组大鼠疾病活动指数（DAI）、结肠大体形态损伤以及组织学评分，采用反转录（RT）-PCR法和Western印迹法检测各组大鼠肠道组织中TLR4／MyD88信号通路相关蛋白——TLR4、MyD88、肿瘤坏死因子受体相关因子6（TRAF-6）、核因子κB（NF—κB）、肿瘤坏死因子α（TNF-α）、白细胞介素1β（IL-1β）的表达。结果模型对照组大鼠DAI、结肠大体形态损伤及组织学评分均显著高于正常对照组（均P〈0．01），大鼠造模成功；TwP高剂量组的DAI评分、结肠大体形态损伤评分及组织学评分均低于模型对照组[（0．87±0．25）比（1．60±0．76）分，（3．93±1．94）比（5．40±2．21）分，（5．45±2．73）比（13．27±3．50）分，均P〈0．05]。模型对照组大鼠TLR4、MyD88、TRAF-6、NF—κB、TNF-α、IL-1βmRNA及蛋白表达明显高于正常对照组（均P〈0．01）；TWP高剂量组上述指标mRNA及蛋白表达均明显低于模型对照组（mRNA：2．166±0．475比5．647±0．275、1．295±0．087比3．774±0．418、1．125±0．188比2．535±0．320、1．201±0．152比2．082±0．077、1．525±0．218比3．094±0．022、1．797±0．257比17．152±0．145；蛋白：0．252±0．010比0．277±0．008、0．172±0．002比0．213±0．005、0．233±0．006比0．248±0．003、0．099±0．003比0．122±0．007、0．238±0．002比0．252±0．005、0．235±0．003比0．245±0．006，均P〈0．05），AZA组上述指标mRNA及蛋白表达明显低于模型对照组（均P〈0．01），TWP高剂量组与AZA组之间差异无统计学意义（均P〉0．05）。结论TWP能减轻肠道炎症反应，促进黏膜愈合，对UC具有治疗作用；抑制TLR4的表达，影响MyD88引发信号通路下游的TRAF-6表达，从而抑制NF—KB的活化，减少炎症因子TNF-α、IL-1β的释放是其作用机制之-。

TNBS/乙醇溃疡性结肠炎大鼠模型差异表达 miRNA 与 mRNA 共表达分析

目的 研究2,4,6-三硝基苯磺酸（ TNBS）/乙醇溃疡性结肠炎（ UC）大鼠中,UC相关miRNA的调控作用,即miRNA与mRNA互作关系. 方法 用TNBS/乙醇灌肠,诱导UC大鼠模型.经过造模与14 d生理盐水灌胃后,解剖处死. 留取正常组与模型组大鼠相应的结肠组织. 通过大体及镜下观察,验证造模效果. 同时对相应结肠组织进行miRNA芯片检测,根据芯片结果及相关文献报道,筛选出与UC发病密切相关的miRNA并对其进行RT-PCR验证. 另外,利用miRWalk数据库对差异miRNA的靶基因进行预测. 为了验证预测结果与实际情况的相符度,又同步进行了mRNA水平的表达谱芯片实验,筛选出与差异miRNA确有互作作用的mRNA. 为了更好地说明miRNA与mRNA的互作关系,又利用David数据库对靶基因进行注释,最终形成miRNA与mRNA共表达网络. 结果模型组大鼠结肠大体及镜下表现均符合UC 的发病特征. 通过 miRNA芯片筛选出了68 个差异miRNA[倍数变化（fold change）〉2, P〈0.05,表达值（expression mean）〉7],结合相关文献报道,筛选出6个与UC发病密切相关的miRNA. 同时对这6个miRNA进行了RT-PCR实验,结果提示,与正常组相比,4个差异miRNA（ miR-146a-5p、miR-146b-5p、miR-126a-3p和miR-21-5p）表达明显上调（ P〈0.01,P〈0.05）,2个差异miRNA（miR-200b-3p、miR-145-5p）表达明显下调（P〈0.01）. 结合miRWalk数据库对这6个差异miRNA的靶基因预测结果和表达谱芯片结果,本研究发现IL-6、Ccl5、Mapk3、Smad7这4个mRNA与上述6个miRNA有互作关系. 最终通过David数据库对这种互作关系进行注释,以阐明其在UC发病中的重要作用. 结论 一个miRNA可以调控多条信号通路,而一条信号通路又受到多个miRNA的调控. 如果仅仅单纯抑制某条信号通路,可能并不能从根本上抑制炎症的发生. 而从其上游出发,研究miRNA作用,阐明相互关系,并调控mRNA的作用,可能可以从根本上逆转疾病的进程.

超声心动图及心肌酶谱检测在急性肺栓塞中的临床应用价值

目的探讨超声心动图及心肌酶谱检测在急性肺栓塞(acute pulmonary embolism,APE)中的临床应用价值。方法选取2014年6月—2016年5月于杭州师范大学附属医院就诊的急性肺栓塞患者60例作为研究组。另选同期健康体检者60例作为对照组。采用超声心动图观察2组右室舒张末期容积(EDV)、收缩末期容积(ESV)、每搏输出量(SV)、射血分数(EF),峰值排空率(PER)和峰值充盈率(PFR)之间的差异,采用全自动生化仪检测2组血清心肌酶谱指标肌酸激酶(CK)、肌酸激酶同工酶(CK-MB)、乳酸脱氢酶(LDH)、谷草转氨酶(AST)水平差异,并观察心功能不全患者与心功能正常者肺栓塞恶化及死亡情况。结果与对照组相比,研究组患者EDV、ESV明显增大(P<0.05),SV有所下降,但2组差异无统计学意义(P>0.05),EF、PER、PFR明显减小(P<0.05);研究组CK、CK-MB、LDH、AST指标水平均明显高于对照组(P<0.05);60例急性肺栓塞患者中心功能不全者29例,心功能异常者肺栓塞相关恶化率及病死率均明显高于心功能正常者(P<0.05)。结论超声心动图有助于评价急性肺栓塞患者的右心功能,心肌酶谱检测有助于评估急性肺栓塞患者的心肌损伤情况,超声心动图及心肌酶谱检测有助于患者诊断和预后评估。

雷公藤多苷片对溃疡性结肠炎大鼠miR-146a、miR-146b及TLR4/MyD88依赖信号通路的调控作用研究

目的研究雷公藤多苷片(TWPT)对2,4,6-三硝基苯磺酸(TNBS)/乙醇溃疡性结肠炎(UC)大鼠微小RNA(mi R-146a、mi R-146b)及TLR4/My D88依赖信号通路的调控作用。方法采用TNBS/乙醇灌肠法制备UC大鼠模型。将90只雄性Wistar大鼠随机分为对照组,模型组,TWPT低、中、高剂量(30、60、120 mg/kg)组,硫唑嘌呤(AZA,60 mg/kg)组,每组15只。各组分别ig给予相应药物连续14 d。进行各组大鼠结肠组织大体及镜下病理评分。采用q RT-PCR法检测mi R-146a和mi R-146b的表达情况;Western blotting法和RT-PCR法检测大鼠结肠组织中TLR4/My D88依赖信号通路相关分子(TLR4、My D88、TRAF-6、NF-κB、TNF-α、IL-1β)在m RNA及蛋白水平的表达情况。结果 DAI评分,大体及镜下表现和评分均提示TNBS/乙醇UC大鼠模型造模成功,TWPT对UC大鼠临床症状的改善及黏膜愈合具有一定作用,该作用与AZA相比相当或强于AZA。q RT-PCR结果提示:与对照组相比,模型组中mi R-146a和mi R-146b表达明显增加(P<0.01);与模型组相比,TWPT及AZA均可显著抑制mi R-146a和mi R-146b的表达(P<0.01),其中TWPT中剂量组对2者的抑制作用最强。RT-PCR及Western blotting实验均提示:与对照组相比,模型组中TLR4/My D88依赖信号通路相关的分子无论在m RNA还是蛋白水平表达均显著升高(P<0.01);与模型组相比,TWPT呈剂量依赖性地抑制该信号通路上各节点分子m RNA及蛋白水平的表达,其中TWPT高剂量组中各节点分子m RNA及蛋白表达水平低于模型组(P<0.05)。与AZA组比较,TWPT高剂量组对该信号通路上游因子(TLR4、My D88、TRAF-6、NF-κB)m RNA及蛋白表达水平的抑制作用略好于AZA组,而对末端炎症因子TNF-α及IL-1βm RNA及蛋白水平的抑制作用却略逊于AZA组,但上述2种差异均无统计学意义(P>0.05)。结论在TNBS/乙醇UC大鼠模型中,TWPT能通过抑制mi R-146a和mi R-146b的表达,并能抑制TLR4/My D88依赖信号通路及炎症因子IL-1β及TNF-α释放,对信号通路及炎症因子的作用强度与剂量呈正相关。

肠易激综合征小鼠粪便代谢组学及炒白术干预作用研究

目的通过检测肠易激综合征(IBS)小鼠粪便代谢物产物,以期反映肠道菌群代谢变化,并以中药炒白术作为干预药物,观察药物对肠道菌群代谢的影响。方法 18只雌性C57BL/6小鼠随机分为正常对照组、模型组、白术组,每组6只。除正常对照组外,其余小鼠采用避水应激法(WAS)建立IBS小鼠模型。造模10天后,白术组给予炒白术煎剂灌胃,对照组及模型组给予等体积生理盐水灌胃,持续7天。观察各组小鼠给药后腹肌收缩反射(AWR)评分及粪便性状变化。收集并计数实验开始第0、5、10及17天的小鼠粪便颗粒数。运用气相色谱-质谱(GC-MS)检测以及多变量统计学数据分析,比较正常对照组和模型组,白术组和模型组的粪便代谢产物。结果正常对照组和模型组存在粪便代谢产物差异,共鉴定出14种差异代谢物。苯丙氨酸代谢是最相关代谢通路。白术组较模型组小鼠粪便成形,颗粒数减少(P<0.05),AWR评分降低(P<0.05,P<0.01)。白术组和模型组共鉴定出16种差异代谢物。苯丙氨酸代谢、烟酸和烟酰胺代谢及泛酸和辅酶A生物合成是最相关代谢通路。结论 IBS小鼠存在粪便代谢产物及代谢通路改变,提示肠道菌群代谢紊乱。中药炒白术可改善IBS小鼠内脏敏感性及粪便性状,可能与影响肠道菌群代谢相关。