教师如何提升医学微生物学授课水平

医学微生物学是一门重要的医学基础课程,因其知识点庞杂,内容枯燥,学生学习积极性不高。如何在有限的学时数内,讲好该门课程,提高学生学习兴趣,让其真正学到实用知识,是每个该课程的授课教师需要认真思考的课题。教师可通过练好教学基本功、掌握新知识新进展、引导学生理论联系实际、运用多种教学方法和教学手段、针对不同层次不同专业的学生因材施教等举措,提高医学微生物学授课水平。

贵州省麻江县少数民族男性不育症影响因素调查

目的:探讨贵州省麻江县少数民族男性不育症的影响因素。方法:抽取贵州省麻江县3个村落的结婚1年以上未避孕的256对育龄夫妇进行问卷调查,统计男性不育症的发病率及影响因素。结果:256对育龄夫妇中,有46例男性不育家庭(17.97%),其中遗传因素(OR=2.906)、有机溶剂农药接触史(OR=3.333)及泌尿生殖道感染(OR=4.742)可能是导致该地区男性不育的主要因素。结论:贵州省麻江县少数民族男性不育是多种因素导致的结果,应重视改变不良生活习惯和行为方式,加强职业防护,积极治疗泌尿生殖道疾病。

11株临床诺卡菌16S rRNA及药敏分析

目的:探讨应用11株临床诺卡菌16S rRNA序列鉴定该菌菌种名,同时观察该菌的药敏情况。方法:将11株临床分离的诺卡菌菌株分别接种于脑心浸液琼脂培养基分离培养,观察其生长情况;提取菌株DNA,聚合酶链式反应(PCR)扩增其16S rRNA序列,并测定其基因序列,所获序列与Gen Bank数据库进行BLAST比对,鉴别其菌种名;采用Kirby-Bauey纸片扩散法检测11株菌株药敏情况。结果:11株临床诺卡菌在脑心浸液琼脂培养基上生长迅速;PCR扩增菌株16S rRNA基因序列经BLAST比对,结果与Gen Bank中已知的诺卡.菌同源性>98%,分离的菌株分别为Nocardia otitidiscaviarum 4株、Nocardia cyriacigeorgica 3株、Nocrdia wallacei1株及Nocardia farcinica3株;药敏实验结果显示11株诺卡菌均对阿米卡星敏感,对亚胺培南耐药,其中Nocardia cyriacigeorgica对氨苄西林、环丙沙星、克拉霉素及阿莫西林的药物敏感性结果与其它菌株截然不同。结论:测定16S rRNA序列能够快速、简便、准确地鉴定诺卡菌菌种,各菌株均对阿米卡星敏感,对亚胺培南耐药。

16SrRNA和secA1基因构建临床诺卡菌的系统发育树比较

目的:比较16S rRNA和secA1基因构建诺卡菌分属Nocardia wallacei、Nocardia farcinica、Nocardia cyriacigeorgica及Nocardia otitidiscaviarum4个种系统发育树的多样性。方法:将8株临床分离的诺卡菌菌株分别接种于脑心浸出液琼脂培养基分离培养,观察其生长情况;提取细菌DNA,采用聚合酶链式反应扩增其16S rRNA和secA1基因序列并测序,所获序列与NCBI数据库进行BLAST比对,鉴定其菌种名;选取本研究鉴定的4个属共有的40个有效发表种及本研究分离的8株诺卡菌菌株的种,通过邻接法、最大似然法分别构建16S rRNA和secA1基因序列的系统发育树并比较。结果:本研究所收集的诺卡菌分属Nocardia wallacei、Nocardia farcinica、Nocardia cyriacigeorgica及Nocardia otitidiscaviarum 4个种,且Nocardia wallacei、Nocardia farcinica及Nocardia cyriacigeorgica基于secA1基因构建的系统发育树较16S rRNA在种内菌株亲缘关系的分化差异程度高及分类多样性多(P<0.05),而Nocardia otitidiscaviarum的分化程度和分类多样性在16S rRNA和secA1基因构建的系统发育树间差异无统计学意义(P>0.05)。结论:secA1基因用于诺卡菌种群的系统发育分析和分子进化的研究,较16S rRNA具有高度分辨率的优势。

胃黏膜中球形幽门螺杆菌的鉴定与临床意义

目的:对球形幽门螺杆菌(Helicobacter.Pylori,H.pylori)进行鉴定,探讨其临床意义。方法:胃镜下确诊的胃炎及消化性胃溃疡患者的胃黏膜组织标本进行H.pylori分离培养、尿素酶检测,对革兰阴性(G^-)弯曲杆菌和不典型球菌进行H.pylori特异性PCR鉴定,并对特异性PCR阳性的不典型球菌以H.pylori 16S r DNA通用引物扩增测序。结果:共获得80株G^-弯曲杆菌和5株不典型球菌,在传代培养中有24株弯曲杆菌发生球形变异;G^-弯曲杆菌的组织及细菌培养物尿素酶试验均为阳性,G^-不典型球菌的组织及细菌培养物为阴性,返祖为G^-弯曲杆菌后则为阳性;85株菌经特异性引物鉴定均为H.pylori阳性,G^-不典型球菌16S rDNA序列与数据库中H.pylori 16S rRNA基因序列碱基一致性均达99%,鉴定为H.pylori。结论:H.pylori可发生球形变异,这可能会造成临床实验室微生物学诊断的假阴性。

D1/D2、MLST及MALDI-TOF MS在新生隐球菌分类中的应用

目的:比较单一D1/D2区域测定、多位点测序分型技术(MLST)和基质辅助激光解吸-飞行时间质谱技术(MALDI-TOF-MS)在新生隐球菌(Cryptococcus podzolicus)及与之邻近的其他种属的分类研究的稳定性和可靠性。方法:挑选以Cryptococcus podzolicus为主及与之相邻的其他种和属的菌株共20株及1株outgroup模式菌株,运用酵母菌基因组提取试剂盒提取其DNA,PCR扩增5个管家基因(ITS,D1/D2,rpb1,rpb2,tef1)并测序,以Bayesian法(Mr Bayes3.2.1)、最大似然法、邻接法(MEGA 6.0软件)分别构建5个管家基因及D1/D2基因序列的系统发育树;应用MALDI-TOF-MS采集蛋白指纹图谱,在Bruker Daltonics数据库(BDAL)和CBS真菌保藏中心数据库信息的基础上,对20株菌进行聚类分型,构建聚类分型树状图。结果:3种方法所得树状图在种间的层面上,均出现了a、b、c 3个分支;在种内的层面上,特别是a这一分支,均为Cryptococcus podzolicus,单一D1/D2区域所构建的系统发育树分化程度不大,各菌株间无明显的分类多样性,而MLST及MALDI-TOF MS所得到的树状图在种内均出现了明显的分类多样性及亲缘关系的差异性。结论:MLST及MALDI-TOF MS均可作为隐球菌属中菌株分类鉴别中有效的分子生物学方法,能可靠地揭示隐球菌属中各菌种的种间及种内的遗传进化关系,MALDI-TOF-MS比MLST则更为快捷准确。

实时荧光定量PCR检测胃黏膜及粪便中的幽门螺杆菌核酸

目的:应用实时荧光定量PCR(q PCR)快速检测幽门螺杆菌(H.pylori)核酸。方法:胃镜检查获取的120例胃疾病患者胃黏膜标本,采用分离培养、PCR和q PCR检测H.pylori特异性16Sr DNA的方法诊断H.pylori感染,比较3种方法检测结果的阳性率;收集30例H.pylori感染确诊患者的粪便标本,采用酶联免疫分析法检测H.pylori抗原(H.pylori-Ag)及q PCR法检测H.pylori感染情况,比较两种方法的H.pylori检出率。结果:120例胃肠道病疾患者的胃黏膜中,分离培养出H.pylori 46例,阳性率为38.33%;16Sr DNA PCR检测出H.pylori60例,阳性率为50.00%;q PCR检测出H.pylori 93例,阳性率为77.50%;3种方法阳性率经χ2检验,P<0.05,q PCR法检出率大于分离培养及普通PCR法;18例14C-UBT阳性患者的粪便H.pylori-Ag的阳性率为5.55%,q PCR阳性率为22.22%,经χ2检验,P>0.05。结论:q PCR法可快速检测胃黏膜中H.pylori核酸。

工厂化生产香肠肠衣腐烂黑斑中嗜盐细菌的分离鉴定及其特征特性

为工厂化生产的相关食品及农产品储存过程中微生物的鉴定及抑菌对策提供理论依据,采用高盐察氏液体培养基（Czapek Dox Broth）梯度盐浓度培养法,CDA（Czapek Dox Agar）及TSA（Trypticase Soy Agar）固体培养基进行分离纯化,16SrRNA基因测序,邻接法构建16SrRNA序列的系统发育树等方法,对工厂生产香肠肠衣腐烂黑斑中嗜盐细菌进行分离鉴定,研究其特征特性。结果表明：25%~30%盐浓度固体培养基中分离到3株嗜盐细菌（Gyfl1,Gyfl2,Gyfl3）,经分子学分析鉴定Gyfl1为Halomonas variabilis,Gyfl2为Chromohalobacter israelensis,Gyfl3为Chromohalobacter canadensis;经药敏试验,庆大霉素、卡那霉素、利福平、红霉素和新霉素等常见抗生素均能抑制嗜盐菌株Gyfl1、Gyfl2和Gyfl3,而利福平抑菌效果更明显。

贵阳市结核分枝杆菌链霉素和乙胺丁醇耐药相关基因突变的检测与分析

目的了解贵阳市及周边地区结核分枝杆菌链霉素和乙胺丁醇耐药相关基因rpsl、rrs和embB的突变特征。方法对39株结核分枝杆菌临床分离株(乙胺丁醇和链霉素均耐药菌株19株,均敏感菌株20株)的rpsl、rrs和embB基因片段进行PCR扩增和测序,以H37Rv菌株序列为参考,比较耐药菌株和敏感菌株的突变特征。结果 19株耐药菌株中有14株检出rpsl基因突变,突变率为73.7%(14/19),其中12株为AAG43AGG突变,1株为AAG43AAT突变,1株为AAG88AGG突变;20株敏感菌株中有1株发生rpsl基因AAG43AGG突变,突变率为5.0%;耐药菌株和敏感菌株均未检测出rrs基因突变。19株耐药菌株中有16株检出embB基因突变,突变率为84.2%(16/19),突变包括6株ATG306GTG突变,ATG306ATA、ATG306ATT和ATG306ATC突变各1株;GGC406GCC和GGC406AGC突变各3株,1株CAG497CGG突变;20株敏感菌株未检测出突变。结论贵阳地区结核分枝杆菌菌株链霉素和乙胺丁醇耐药相关基因突变具有多样性;优势突变分别为rpsl43和embB306位点突变。

医院泌尿系统感染病原菌的分布及耐药谱

目的:探讨医院泌尿系统感染病原菌的分布及耐药谱。方法:收集720例泌尿系感染患者中段晨尿,采用常规方法分离细菌,全自动细菌鉴定和药敏检测系统鉴定病原菌并进行药敏检测,分析泌尿系感染的菌种及其耐药性。结果:获得745株病原菌中G-菌构成比高于G+菌,P<0.05;G-菌中大肠埃希菌最高、其次为肺炎克雷伯菌和铜绿假单胞菌;G+菌中屎肠球菌最高、其次为粪肠球菌和金黄色葡萄球菌;G-杆菌中的大肠埃希菌、肺炎克雷伯菌及阴沟肠杆菌和非发酵菌中铜绿假单胞菌、鲍曼不动杆菌对亚胺培南最敏感,大肠埃希菌、肺炎克雷伯菌及阴沟肠杆菌耐药率最高为氨苄西林、其次为哌拉西林和头孢唑林,铜绿假单胞菌对阿莫西林-克拉维酸、氨苄西林、头孢唑林的耐药率高达100%,鲍曼不动杆菌头对多数常用抗菌药物的耐药率均>60%;G+球菌中的屎肠球菌对19中抗菌药物中11种耐药率>90%,而粪肠球菌中耐药率>90%为5种,2种球菌对亚胺培南、利耐唑胺及呋喃妥因均敏感;葡萄球菌属中金黄色葡萄球菌、溶血葡萄球菌及表皮葡萄球菌对利耐唑胺、呋喃妥因、高浓度链霉素、哌拉西林/他唑巴坦及万古霉素均敏感。结论:本组泌尿系统感染患者病原菌以大肠菌群为主,分离菌株对常用抗生素的耐药现象普遍,但分离菌株中G-菌对亚胺培南较为敏感,G+菌对万古霉素、利耐唑胺较为敏感。

几类主要病原需氧放线菌菌属的SecA1基因分析研究

目的了解几类主要病原需氧放线菌不同菌属间SecA1基因碱基突变特点,为病原需氧放线菌的实验室诊断,分类及致病性提供一定的实验室理论数据。方法以162株需氧放线菌为实验研究对象,通过分子生物学方法对需氧放线菌SecA1基因扩增测序,及收集NCBI数据库中已发表的需氧放线菌SecA1基因,运用多序列对比及DNAStar软件对需氧放线菌SecA1序列进行特异性基序分析及SecA1蛋白的二级结构和表位特性预测。结果需氧放线菌不同菌属间SecA1序列在300～350bp区域有着特异性差异,经预测该区域编码的SecA1蛋白二级结构属间大致相同,而蛋白质柔性区域、亲水性及表面可及性等性质在属间存在差异,其中以Mycobacteria菌属的差异较为明显。结论需氧放线菌SecA1基因不同菌属间具有特异性的碱基突变,这种突变导致属间SecA1蛋白部分性质有差异,与各菌属致病性可能存在着一定的相关性。

贵阳市某医院非结核分枝杆菌流行状况分析

目的:了解2012-2013年贵阳市非结核分枝杆菌(NTM)的流行情况。方法:对贵阳市某医院2012-2013年就诊的可疑结核病患者进行分枝杆菌的培养鉴定,采用PCR-荧光探针及基因芯片法进行鉴定,并对相关结果进行分析。结果:1 500例患者经分离培养和PCR-荧光探针及基因芯片法鉴定为结核分枝杆菌感染的1 469例,鉴定为NTM感染的31例,占2.06%,其中8株为鸟分枝杆菌,10株为胞内分枝杆菌,9株为龟或脓肿分枝杆菌,偶然分枝杆菌、瘰疬分枝杆菌、堪萨斯分枝杆菌及蟾蜍分枝杆菌各1株,分别占NTM 25.80%、32.25%、29.03%、3.23%、3.23%、3.23%、3.23%;NTM感染的阳性患者中,男女比例为1.21∶1,30~59岁年龄段占61.29%;不同性别的感染高峰年龄段不同,男性以75~89岁、女性则以45~59岁年龄段。结论:贵阳市存在一定比例的NTM菌感染,以鸟分枝杆菌、胞内分枝杆菌、龟/脓肿分枝杆菌为主。

分子信标探针技术用于PCR检测诺卡氏菌SecA1基因

目的将诺卡氏菌属细菌的一段特异性DNA设计成分子信标探针,用于该细菌的PCR检测。方法将诺卡氏菌属细菌、戈登氏菌属细菌及红球菌属细菌菌株分别接种于脑心浸液琼脂培养基分离培养,观察其生长情况,提取菌株DNA作为扩增模板;设计诺卡氏菌属细菌基于secA1基因的特异性分子信标探针,在实时荧光定量PCR反应译体系中加入分子信标探针,PCR产物进行荧光信号检测。结果诺卡氏菌secA1基因经实时荧光定量PCR扩增后可产生阳性荧光信号,红球菌属细菌及戈登氏菌属细菌的secA1基因、阴性对照实验组及空白对照组经实时荧光定量PCR扩增后不产生荧光信号,为阴性。结论 secA1作为看家基因,是用来进行种水平的鉴定及系统进化研究非常理想的靶分子,而分子信标探针技术可以准确、快速、灵敏的进行诺卡氏菌secA1基因检测。

结核分枝杆菌耐药相关基因突变及其检测

目前结核病是严重威胁人类健康的重要杀手。据世界卫生组织(WHO)统计数据显示,全球近1/3的人口已经感染了结核分枝杆菌,每年新增结核病患者约900万,每年死亡人数约300万,而我国结核病患病人数占全球的14.3%,位居全球第二位,是全球22个结核病高负担国家之一。由于抗结核药物的不规范使用,导致了耐多药肺结核(MDR-TB)、广泛耐药性肺结核(XDR-TB)的出现和传播,全球每年新发耐多药结核病病例约500 000起,其中。

念珠菌RPB1基因片段PCR扩增条件的优化

目的:优化念珠菌RNA聚合酶Ⅱ大亚基(RPB1)基因片段的PCR扩增条件,筛选适宜念珠菌RPB1的PCR扩增体系。方法:使用改良CTAB法提取念珠菌基因组DNA,分别调整念珠菌RPB1基因片段PCR扩增过程中dd H2O含量、DNA模板含量、退火温度或循环次数,比较不同反应体系的PCR扩增效果。结果:在26μL的PCR反应体系中,DNA模板含量2μL、退火温度为56℃、循环40次时是念珠菌RPB1基因片段最稳定的PCR扩增反应体系,扩增得到24条皱褶念珠菌RPB1基因片段序列,上传至Gen Bank。结论:优化PCR扩增条件后,念珠菌RPB1基因片段的目的条带更明亮、清晰,为基因测序及深入研究念珠菌的工作奠定了基础。

AβOs对大鼠原代海马神经细胞丝裂原活化蛋白激酶信号转导通路的影响

目的:观察β-淀粉样蛋白寡聚体(AβOs)对原代培养大鼠海马神经细胞丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)信号转导通路的影响。方法:原代培养大鼠海马神经细胞,用免疫荧光染色鉴定纯度,制备并鉴定AβOs,用不同浓度AβOs(0.25、0.5、1及10μmol/L)处理细胞48 h,采用CCK-8试验检测细胞的存活率,蛋白印迹法(Western blotting)检测细胞中细胞外信号调节蛋白激酶(ERK)、c-Jun氨基末端激酶(JNK)及p38磷酸化及总蛋白表达水平。结果:免疫荧光染色结果显示原代大鼠海马神经细胞的体外培养纯度达85%以上;低于0.5μmol/L AβOs对原代神经细胞无明显毒性作用,但可见phospho-ERK1/2和phospho-JNK蛋白表达升高;1μmol/L及更高浓度的AβOs对原代神经细胞有细胞毒性作用,同时可引起phospho-ERK1/2和phospho-JNK蛋白表达水平均降低,但总ERK1/2及总JNK蛋白表达水平未受明显影响,而phospho-p38及总p38蛋白表达水平与AβOs作用浓度呈负相关。结论:AβOs与MAPK信号通路之间的作用可因AβOs的作用浓度不同而出现差异。

不同来源茶树组织的茶多酚含量比较

目的:比较不同茶树组织中茶多酚的含量,为茶树修剪枝叶的利用提供参考。方法:通过生石灰水沉淀法提取绿茶树的新鲜叶、干燥叶、新鲜树枝、干燥树枝的茶多酚粗提取物和纯化茶多酚,比较4种茶树组织的茶多酚粗提取物质量及提取率;采用分光光度计法测定标准茶多酚吸光度(A)值,绘制茶多酚标准曲线,通过4种茶树组织纯化茶多酚的吸光度(A)值在标准曲线上获得茶多酚含量并计算其纯度,比较4种茶树组织纯化茶多酚含量和纯度。结果:茶树组织茶多酚粗提取物质量及提取率从高到低依次为新鲜叶、干燥叶、新鲜树枝及干燥树枝,茶多酚含量从高到低依次为新鲜叶、干燥叶、新鲜树枝及干燥树枝,纯度从高到低依次则为新鲜叶、新鲜树枝、干燥叶及干燥树枝。结论:新鲜茶叶和新鲜茶树枝的茶多酚含量较高,可为茶叶及茶树枝综合开发利用提供参考。

家蝇幼虫干粉对小鼠血液部分生理生化指标和免疫功能的影响

目的:探讨家蝇幼虫干粉对小鼠血液部分生理生化指标及免疫功能的影响。方法:在小鼠基础饲料中添加5%、7.5%、9%家蝇幼虫干粉喂养30 d,同时设立基础饲料喂养的对照组,取血检测小鼠血红蛋白(Hb)、红细胞(RBC)、白细胞(WBC)和血小板(PLT)、天门冬氨酸氨基转移酶(AST)、丙氨酸氨基转移酶(ALT)、尿素氮(BUN)和肌酐(Cr),通过免疫器官指数、碳粒廓清试验、脾细胞介导的SRBC分光光度计定量测定法(QHS),外周血T淋巴细胞ANAE+阳性率测定评价小鼠免疫功能。结果:与对照组相比,5%家蝇幼虫干粉组ALT含量提高(P<0.05),AST含量降低(P<0.05);7.5%家蝇幼虫干粉组脾指数高于对照组,5%、9%家蝇幼虫干粉组脾指数低于对照组(P<0.05),5%、7.5%和9%家蝇幼虫干粉组胸腺指数均高于对照组(P<0.05);9%家蝇幼虫干粉组吞噬指数α、QHS反应值和ANAE+阳性率均显著高于对照组(P<0.01)。结论:高剂量家蝇幼虫干粉具有增强免疫作用,低剂量可能影响血清生化指标。

洛伐他汀对抗人神经母细胞瘤SH-SY5Y细胞β-淀粉样蛋白的非胆固醇依赖性保护作用

目的:观察洛伐他汀对过表达APP670/671的人神经母细胞瘤SH-SY5Y细胞活性及β-淀粉样蛋白(Aβ)二聚体合成的影响。方法:转染并鉴定过表达APP670/671的SH-SY5Y细胞,筛选无细胞毒性、不影响细胞胆固醇水平浓度的洛伐他汀处理SH-SY5Y细胞24 h,采用CCK-8试验检测细胞的存活率,蛋白印迹法检测Aβ二聚体的蛋白表达水平。结果:过表达APP670/671的SH-SY5Y细胞中APP的蛋白及mRNA表达水平均明显高于野生型细胞;用0.1μmol/L的洛伐他汀处理SH-SY5Y细胞,未见明显细胞毒性作用,胆固醇水平亦未见明显改变;0.1μmol/L洛伐他汀预处理SH-SY5Y细胞24 h,能提高细胞存活率,减少Aβ二聚体的分泌。结论:洛伐他汀具有神经保护作用,可能与减少毒性Aβ的合成有关。

松油烯-4-醇对人黑色素瘤WM35细胞增殖及凋亡的影响

目的:研究松油烯-4-醇(T4O)对WM35细胞增殖及凋亡的影响并探讨其作用机制。方法:不同浓度T4O体外作用WM35细胞。CCK-8测抑制率;AO/EB染色后倒置显微镜观察细胞形态;比色法测Caspase-3酶活性;流式细胞术测凋亡及周期;JC-1测线粒体膜电位(MMP);蛋白印迹测Bax及Bcl-2表达。结果:T4O以时间-剂量依赖性方式抑制WM35细胞增殖。T4O诱导WM35细胞凋亡,呈剂量依赖性,随药物浓度增加,Caspase-3酶活性逐渐增强,MMP逐渐降低,Bax/Bcl-2比值升高,周期阻滞在G2/M期。结论:T4O对WM35细胞有抑制增殖及促凋亡作用,其机制是通过线粒体途径使凋亡相关蛋白Bax表达上调、Bcl-2下调,激活凋亡途径关键酶Caspase-3,使细胞周期阻滞在G2/M期。