基于口腔黏膜分泌物的快速检测HIV1/2型抗体方法建立及其临床应用研究

感染个体进行 HIV 抗体的检测对 HIV 的诊断和控制至关重要，传统的血液检测法对医院的环境设施及相关医务人员水平的要求较高，也存在交叉感染的危险。研究表明， HIV 感染者的唾液或口腔黏膜渗出液中几乎不含 HIV 病毒，但含有抗 HIV 抗体，并且检出率高。这一发现为艾滋病检测提供了一个全新的发展方向[1-2]。在以口腔分泌物为样本的 HIV 抗体诊断试剂研发领域，虽然国内外曾有报道，但国内至今可成熟应用到临床检测的试剂非常少见。本研究通过工艺摸索及优化，建立了一种基于口腔黏膜渗出液样本检测 HIV1/2型抗体的诊断方法（免疫分析法），为临床提供了适用于 HIV 抗体检测的安全、无创、快速诊断试剂。研制的检测试剂可广泛用于高危人群的流行病学调查和监测，对推进社区医疗和家庭 POCT（point of care testing）在传染病诊断领域的发展具有重要意义。

尿微量白蛋白荧光免疫层析定量检测试剂的研制及性能评价

旨在建立一种快速定量检测人尿液中微量白蛋白的荧光免疫层析方法。以羧基荧光微球标记的抗人白蛋白单克隆抗体及羊抗兔Ig G为标记抗体,人白蛋白和兔Ig G分别作为检测线和质控线制备荧光免疫层析试纸条。结果显示,所制备检测试剂的线性范围为5-300 mg/L,检测限为2.3 mg/L,批内和批间变异系数(CV)分别为6.4%-9.3%和6.5%-12.3%,平均回收率为102.3%。试剂与尿液中20种干扰物质无交叉反应,实时稳定性试验表明试剂盒有效期>12月。临床样本测试,与Orion Quik Read U-ALB试剂相关性较好(r=0.993,P<0.01),Bland-Altman分析表明两种方法的诊断结果具有较好的一致性。所制备的荧光免疫层析检测试剂提供了一种简单、快速、准确的定量检测尿液中微量白蛋白的方法。

荧光免疫层析法结合免疫磁珠分离技术快速检测单增李斯特菌

为建立单增李斯特菌简单快速、灵敏度高和特异性强的检测方法,本研究以抗单增李斯特菌单克隆抗体偶联磁珠制备免疫磁珠;以羧基荧光微球标记的抗单增李斯特菌多克隆抗体及鼠IgG为标记抗体,抗单增李斯特菌多克隆抗体和羊抗鼠二抗分别作为检测线和质控线制备荧光免疫层析试纸条。将免疫磁珠分离与荧光免疫层析法相结合应用于单增李斯特菌的现场快速检测中。结果表明:荧光免疫层析试纸条对纯培养单增李斯特菌的检测限为4×105CFU/mL,联合检测方法10倍、100倍浓缩时,检测限分别为4×104CFU/mL和1×104CFU/mL。联合检测体系特异性较好,与实验室保存的10株细菌无交叉反应。人工污染样本检测限为1×104CFU/mL,同纯培养物相比检测灵敏度并没有降低。本方法的建立对于食品中单增李斯特菌的现场快速检测具有重要意义。

基于荧光微球的免疫层析法结合免疫磁珠分离技术快速定量检测鼠伤寒沙门氏菌

为了建立一种能快速、灵敏、特异检测鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium,ST)的方法,本研究以荧光微球(FM)为标记物建立了荧光微球免疫层析检测法(FM-ICA),将羧基化的磁性微球与抗体偶联制备了抗-ST免疫磁珠(IMB),并将FM-ICA与IMB联合用于富集和检测三种食品样本中的ST。在优化条件下,FM-ICA检测的线性范围为3.16×10~6~2×10~9 CFU/m L,回收率为80%~120%,变异系数均小于5%。当菌液浓度大于1×10~8 CFU/m L时,结果显示与同属沙门氏菌的交叉反应;而当菌液浓度小于或等于1×108CFU/m L时,常见的12株非目标菌检测结果为阴性,特异性较好。FM-ICA+IMB联合检测三种模拟食品时的回收率为38%~55%,其中,西红柿对回收率影响较小,鸡蛋和猪肉影响较大。然而,联合检测的灵敏度可达到1×10~5 CFU/m L,比单一FM-ICA方法提高了30倍,同时,整个检测过程可在2 h内完成。本检测方法的建立对于快速筛查鼠伤寒沙门氏菌具有重要意义。

金纳米粒子与抗体蛋白相互作用的光谱研究

本文运用透射电镜(TEM)、Zeta电位测量、紫外-可见吸收光谱(UV-Vis)、荧光光谱以及衰减全反射傅立叶变换红外光谱(ATR-FTIR)等技术手段,研究了免疫球蛋白G(IgG)与金纳米粒子的相互作用。结果表明,所制备的金纳米粒子呈均一分散的球形,抗体蛋白能够与金纳米粒子形成稳定的复合物。内源荧光光谱表明金纳米粒子对抗体蛋白的内源荧光有显著的静态猝灭,猝灭常数KSV=4.25×109 L·mol-1,同时金纳米粒子与抗体蛋白间有较强的作用,结合常数K=1.95×1014,结合位点数n为1.49。外源荧光光谱表明金纳米粒子与抗体蛋白之间的作用力主要是疏水相互作用。ATR-FTIR分析抗体蛋白与金纳米粒子作用前后蛋白二级结构的变化,结果显示,抗体蛋白有序结构含量降低,构象朝着更加松散的状态变化。

人D-二聚体的制备及其冻干性质的分析

以人源纤维蛋白原为原材料制备D-二聚体,将其制成冻干品并分析其冻干性质。使用凝血酶、Factor XIIIa酶解纤维蛋白原,获得交联纤维蛋白。经纤溶酶降解交联纤维蛋白,生成纤维蛋白降解产物。超滤除去纤维蛋白降解产物中的小分子物质,可获得较高纯度的D-二聚体。通过筛选和优化冻干方案,将D-二聚体制备成冻干品。经检测可知,D-二聚体冻干品可在37℃稳定保存12 d;复溶后在25℃稳定保存8 d;复溶后在4℃稳定保存30 d;复溶时,常用复溶溶剂对其复溶后的活性检测无明显影响。

人中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白的原核表达和活性鉴定

目的对人源中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白(NGAL)进行原核表达、纯化,并验证其免疫学活性。方法通过化学合成法合成人源NGAL成熟肽c DNA序列,构建原核表达载体p Cold-NGAL,转化至E.coli BL21(DE3)plys S中。摸索p Cold-NGAL最佳诱导条件,表达并纯化重组蛋白;使用SDS-PAGE、Western blot法和免疫比浊法鉴定纯化后的重组NGAL蛋白的相对分子质量(Mr)和以及与NGAL单克隆抗体(m Ab)的结合活性。结果经双酶切和测序验证,原核表达载体p Cold-NGAL成功构建。优化诱导条件后,重组NGAL蛋白在E.coli BL21(DE3)plys S中以可溶性蛋白形式表达,Mr约为25 000。通过Ni2+亲和层析纯化获得高纯度重组NGAL蛋白,SDS-PAGE分析其纯度高于98.0%。经Western blot法和免疫比浊法鉴定,重组NGAL蛋白可与NGAL m Ab特异性结合。结论成功表达和纯化了重组NGAL蛋白,并具有免疫学活性。

麦角酸二乙基酰胺人工抗原的制备与初步应用

目的 通过化学方法制备麦角酸二乙基酰胺人工抗原并初步应用到胶体金试剂条上。方法 利用碳二亚胺法把化学修饰后的麦角酸二乙基酰胺与载体蛋白连接成为完全抗原,使用质谱法和紫外全波长扫描法验证制备效果,并作为包被原应用于胶体金检测试剂条上。结果 经过330例临床样本测试、60种常用药物交叉反应测试、尿pH和尿比重干扰测试,该抗原能与麦角酸二乙基酰胺抗体在胶体金试剂条上表现出良好的特异性与敏感性。其灵敏度在10ng/ml,特异性为99.06%,敏感性为100%,可在5 min内实现现场尿液快速检测。结论 该方法制备的麦角酸二乙基酰胺人工抗原可用于麦角酸二乙基酰胺胶体金免疫检测方法中。