基于多聚化重组抗原的检测戊型肝炎病毒IgM与IgG抗体的ELISA的建立及初步评估

建立并评估分别检测戊型肝炎 (戊肝 )病毒IgM与IgG抗体的捕获法及间接法ELISA。以原核表达的多聚化重组HEV蛋白为抗原 ,建立戊肝捕获法IgMELISA(E2 -IgM )和间接法IgGELISA(E2 -IgG)。利用 2 9只实验感染猴系列血清及多份临床急性肝炎血清、正常人血清以及单克隆抗体评估所建立的方法的敏感性与特异性 ,并与商品化试剂 (Genelabs公司抗 -HEVIgG和IgM试剂 ,GL -IgG/GL -IgM )进行比较。 2 9只恒河猴E2 -IgM和E2-IgG的阳转率均为 10 0 % ,其中 75 %在感染后 4周内阳转 ,均早于ALT异常时间。E2 -IgM持续 2～ 14周 ,平均6周 ;E2 -IgG在 70周时仍无一阴转。GL -IgG阳转率为 79 3% ( 2 3/ 2 9) ,多数晚于ALT异常时间 ,平均持续约18周 ,但最长为 1只在感染后 70周时仍为阳性。用E2 -IgM试剂盒检测 92 8份正常人血清 ,仅 2份OD值略高于0 2。检测 5 10份临床急性肝炎血清 ,可明显将其区分为 2个部分 ,一个部分OD值小于 0 2 ,其OD值分布与正常人相似 ;另一个部分OD值大于 0 4,共 131份 ,其中 10 9份大于 1 0。可能分别对应于急性肝炎中的非戊肝患者和戊肝患者。 119份非甲～丙急性肝炎中 ,E2 -IgM阳性 5 7份 ,GL -IgM阳性 2 9份 (E2 -IgM均阳性 )。 5 0 6 0份普通人群血清的E2 -IgGOD值在 0 2以下 。

北京血站献血员戊型肝炎流行病学调查

为了解献血员戊型肝炎感染情况,对2002年7～8月向北京市血液中心义务献血的所有人员进行整群抽样并抽血,应用ELISA检测戊型肝炎病毒(HEV)IgG的感染率。结果发现:北京献血员HEVIgG总感染率为26 59%,性别、年龄、省份分布存在着差别,男性比女性感染率高,年龄越大感染率越高,来自高感染省份者感染率也高,但ALT与HEVIgG感染无关。因此,男性、年龄大、来自高感染省份具有较高的HEV感染风险,进一步研究献血员的亚临床感染对HEV的输血安全性具有重要意义。

高致病性H5亚型禽流行性感冒病毒血凝素单克隆抗体的制备与初步应用

以禽流感病毒株Ck/HK/Yu22/02(H5N1)作为免疫原,利用常规杂交瘤技术和血凝抑制试验法成功地筛选出6株稳定分泌抗高致病性H5亚型禽流感病毒血凝素的单克隆抗体(单抗),分别命名为2F2、3C8、3FC1、7C6、10HD4和13G4。经血凝抑制试验法分析,结果发现这6株单抗具有特异性高、反应性强、识别谱宽且互补等特点。基于单抗2F2,初步建立了三种H5N1病毒诊断方法,经评估证实均具有很好的特异性。由此说明,研究制备的抗H5亚型禽流感病毒血凝素单抗可适用于H5N1病毒的诊断。

一种联合检测乙型肝炎病毒前S1抗原与核心抗原方法的建立及其与病毒核酸检测结果的一致性

本研究以与血清中HBV DNA含量高度相关的两种HBV抗原（前S1抗原与核心抗原）为靶标,建立了联合检测这两种HBV核酸相关抗原（NRAg）的双抗体夹心法ELISA试剂。对系列稀释血清的检测表明,该试剂的平均分析灵敏度为103.2基因组拷贝/mL（95%可信限102.2-4.2基因组拷贝/mL）,显著高于前S1抗原或核心抗原的单独检测。对994份HBsAg阴性血清的检测结果表明NRAg ELISA的特异性为99.7%（95%可信限：99.1%-99.9%）。对271份临床慢性肝炎血清进行检测,结果NRAg ELISA与HBV DNA结果的总符合率达96.3%（95%可信限：93.3%-98.2%）,NRAg ELISA的读值/临界值比（S/CO）与HBV基因组拷贝数呈正相关。利用NRAg试剂,发现了1例HBsAg“a”抗原表位突变的变异株。这些结果显示HBV NRAg ELISA与HBV DNA具有高度相关性,并能够检测出HBsAg抗原变异株,有望成为HBsAg变异株筛选的有力工具,并为广大基层医疗单位提供一种便捷的替代HBV DNA定性检测的手段。

大肠杆菌重组颗粒性戊型肝炎疫苗对恒河猴的免疫保护

大肠杆菌表达的戊型肝炎病毒 (HEV)衣壳蛋白ORF2片段HEV 2 39重组蛋白颗粒 ,经铝佐剂吸附后 ,分别以5 μg、1 0 μg和 2 0 μg剂量免疫恒河猴 ,2 8天时以相同剂量加强免疫 1次 ,3周后分别以不同病毒滴度的基因Ⅰ型或基因Ⅳ型HEV静脉攻击。结果 ,加强后 3周 ,3个免疫剂量组猴的抗体几何平均滴度分别为 1∶2 71 75、1∶344 0 9、1∶4 16 0 7,以世界卫生组织参比血清定量 ,则分别为 1 0 98IU/ml,1 35 7IU/ml、1 72 4IU/ml。每个剂量免疫组及对照组各有 3只猴接受 1 0 7病毒滴度基因Ⅰ型HEV感染 ,对照组 3只猴均被成功感染 ,2只出现肝炎 ;2 0 μg免疫组 3只猴均未被感染 ;1 0 μg和 5 μg免疫组各有 2只猴未被感染 ,另 1只猴出现短暂感染 ,免疫猴均未出现肝炎。 3个剂量免疫组及对照组另外 3只猴 ,接受 1 0 4病毒滴度基因Ⅰ型HEV感染 ,对照组 3只猴均被感染 ,1只出现肝炎 ;而免疫猴均未被感染 ,也未出现肝炎。 3只 1 0 μg免疫猴和 3只对照猴分别接受 1 0 7病毒滴度基因Ⅳ型HEV感染 ,对照组均被感染并出现肝炎 ,而免疫组均未出现肝炎 ,有 2只未被感染 ,另 1只被短暂感染。另有 3只 1 0 μg免疫猴和 3只对照猴分别接受 1 0 4病毒滴度基因Ⅳ型HEV感染 ,对照组均被感染 ,而免疫组均未被感染。这些结果表明

重组人类T淋巴细胞白血病病毒抗原及双抗原夹心法ELISA抗体诊断试剂盒的研制

为研制灵敏、特异的抗人类T淋巴细胞白血病病毒(HTLV)抗体诊断试剂,将一段HTLV Ⅰ和HTLV Ⅱenv区嵌合基因在大肠杆菌中表达,获得的重组抗原具有良好活性。将该抗原作为酶标记抗原建立双抗原夹心法ELISA(dsELISA),对31份HTLV Ⅰ型血清和19份HTLV Ⅱ型血清均能100%检出,而在5065份各种阴性血清中特异度为99 94%。用dsELISA试剂与进口间接法试剂(GeneLabs试剂)平行检测18份HTLV Ⅰ参比血清、17份HTLV Ⅱ参比血清和1024份献血员血清,结果dsELISA试剂正确率为100%,对HTLV Ⅰ型血清和HTLV Ⅱ型血清的反应性基本相同,平均s/co值显著高于GeneLabs试剂。而GeneLabs试剂对HTLV Ⅱ型血清的反应性显著弱于Ⅰ型,并有2份BBI参比血清中的Ⅱ型血清漏检。另外,GeneLabs试剂在献血员血清中出现9例假阳性,特异性显著低于dsELISA试剂。这些结果表明:所研制的dsELISA试剂可用于HTLV Ⅰ型和Ⅱ型血清的检测,其灵敏度和特异度均优于进口间接法诊断试剂。

抗戊型肝炎病毒IgG抗体定量线性标准品的标定及初步应用

目的建立抗戊型肝炎病毒(Anti-HEV)IgG抗体的定量线性标准品,并进行初步应用。方法利用抗-HEV IgG和抗-HEV IgM ELISA检测试剂筛选出1份抗-HEV IgG阳性血清L9,经基因1型和4型的HEV ORF2C-端抗原及239抗原进行Western blot确认后,用WHO定量标准品,由3个实验室协作标定,利用量反应平行线法计算其抗-HEV IgG的含量。考察已标定的L9血清的稳定性,并用所标定的1.5倍系列稀释的血清对国内外6家抗-HEV IgG试剂的灵敏度进行检测。选择一灵敏度较高的试剂,在其线性范围内取L9的5个稀释度作为抗-HEV IgG抗体定量线性标准,对高、中、低浓度的3份临床血清重复检测5次,考察其重复性;对实验感染猴的系列血清中抗-HEV IgG含量进行定量检测,考核该定量线性标准品的应用效果;并对每次定量试验中的线性方程进行分析,确定相关系数r值和斜率k值的范围。结果经国内外试剂检测筛选出的阳性血清L9与基因1型和4型的HEV ORF2 C-端抗原及239抗原均有阳性反应。经协作标定,L9血清抗-HEV IgG含量为16.9U/ml。L9血清在-20℃下保存6、12、18个月,2～8℃保存24、48、96h后,定量结果均在95%置信区间内,且抗-HEV IgG含量均未明显下降。6家抗-HEVIgG检测试剂灵敏度差异较大,范围为0.03～5.00U/ml。确定L9血清从0.42U/ml开始的5个1.5倍系列稀释度,作为某一试剂抗-HEVIgG抗体定量线性标准品。利用该线性定量标准检测高、中、低浓度的3份临床血清,定量结果重复性较好;对实验感染猴系列血清进行定量检测,结果可有效地反映抗体水平变化趋势;94%的定量检测试验,r≥0.98,1.15≥k≥0.95。结论已建立了抗-HEVIgG抗体定量线性标准品,可用于疫苗免疫原性评价和流行病学调查。

戊型肝炎病毒抗体双抗原夹心法ELISA的建立与初步应用

目的 建立抗戊型肝炎病毒 (HEV)抗体检测的双抗原夹心ELISA(DS -ELISA) ,并应用于多种动物血清的检测。方法 将大肠杆菌表达的一段HEVORF2区重组抗原分别包被微孔板和进行辣根过氧化物酶 (HRP)标记 ,利用 5份阳性血清和 4 0份阴性血清建立双抗原夹心ELISA ;用 4 0 0份义务献血员血清比较双抗原夹心ELISA与间接法IgG抗体ELISA的符合情况 ;用 3只HEV感染猴系列血清比较双抗原夹心ELISA试剂和Genelabs公司HEVIgG试剂 ;用双抗原夹心ELISA试剂检测新疆地区的部分牛、绵羊、山羊、猪血清和上海地区的部分鸡血清中的HEV抗体。结果 建立了检测HEV抗体的双抗原夹心ELISA方法 ,对 4 0 0份义务献血员血清的检测表明其与间接法IgG抗体ELISA试剂的符合情况良好 ,并且有更高的s/co比值 ;与Genelabs公司HEVIgG试剂的比较表明双抗原夹心ELISA试剂的检出更早 ,尤其是持续时间及强度明显优于Genelabs试剂 ;在所检测的各种动物中均发现了HEV抗体 ,其中猪抗体的阳性率最高 ,表明双抗原夹心ELISA试剂可同时用于不同动物的抗HEV抗体检测。结论 利用大肠杆菌表达的HEV重组抗原建立了双抗原夹心法ELISA ,并可同时用于不同动物的抗HEV抗体检测。

不同HDV诊断试剂对HBsAg阳性样品的检测分析

目的比较HDV抗原,-抗HDV IgM和抗-HDV总抗体诊断试剂在我国HBsAg阳性样品中的检出情况。方法利用7个来自不同厂家的HDV抗原、抗-HDV IgM和抗-HDV总抗体诊断试剂对收集自我国各地的HBsAg阳性样品进行检测,比较分析各血清学试剂的检出差异。对以上血清学指标阳性的样品利用Rt-PCR方法进行HDV RNA核酸检测,PCR产物直接测序,与HDVⅠ、Ⅱ和Ⅲ基因型的序列进行比较,构建进化树划分基因型。结果 687份HBsAg阳性样品中HDV抗原,抗-HDV IgM和抗-HDV总抗体的阳性率范围为0%-5.17%,各试剂间阴性符合率均大于95%,阳性符合率小于50%。34份HDV血清学指标阳性的样品中2份HDV RNA阳性,均为Ⅰa基因型。仅抗-HDV总抗体试剂C1和IgM试剂C2可全部检出该HDV RNA阳性的2份样品。结论本研究发现的HDV均为Ⅰa基因型,我国HDV诊断试剂的质量需要进一步提高。

基于函数链神经网络的热电阻非线性校正

提出基于函数链神经网络的热电阻非线性自校正方法。与BP神经网络相比,函数链神经网络具有结构明晰、算法简单、易于收敛的优点,同时也具备函数学习功能。首先阐述了函数链神经网络解决热电阻非线性问题的原理和实现,然后用实例证明了这种方法的可行性和有效性。

艾滋病毒重组抗原及第三代艾滋病毒抗体EIA诊断试剂盒的研制

近年来中国的艾滋病毒(HIV)感染人数以每年30%的速度增长,HIV感染者总数已超过60万人,感染者已从吸毒人员、献血员等高危人群扩展到社会各个阶层,我国已处于艾滋病泛滥前的关键时期.HIV诊断试剂盒是HIV防制工作中最重要的技术工具.用于人群筛检的HIV诊断试剂盒已历经三代,第一代试剂盒主要使用来自细胞培养的HIV病毒的裂解产物作为抗原;第二代产品使用基因工程重组抗原和/或人工合成肽作为抗原,使包被抗原中免疫优势区的比例明显增强,从而提高了试剂的灵敏度,而且标准化生产的相对更纯的抗原的使用使试剂的特异性和重复性均大为提高.前两代试剂均采用间接法原理,即先以抗原包被聚丙乙烯板,再加入待检血清,最后加入酶标记的抗人IgG抗体,因此均只能检测IgG抗体.1992年问世于美国的第三代试剂则采用双抗原夹心法,即先以抗原包被,再加入待检血清、酶标记的抗原,从而可同时检测所有类型的抗体,明显提高了试剂的灵敏度,同时由于采取了双抗原识别机制,特异性也得到了明显提高,因此在国外已取代间接法而成为主流试剂.

人丙氨酸氨基转移酶基因(ALT1)的克隆、表达、纯化及酶活性的鉴定

目的克隆、表达、纯化重组人丙氨酸氨基转移酶(ALT1),并测定该酶活性,为建立特异性的ALT分型检测方法奠定基础。方法通过RT-PCR从肝癌细胞中扩增丙氨酸氨基转移酶(ALT1)基因,并将其克隆至pET-28 a表达载体中。重组表达质粒pET28 a-ALT1,转化大肠杆菌BL21,经1.0mmol.L-1IPTG诱导,表达可溶性重组融合蛋白,通过硫酸铵沉淀、镍离子柱亲和色谱及QHP柱色谱3步纯化,并检测融合蛋白活性。结果经过表达条件的优化增加了可溶性蛋白的表达,纯化后目的蛋白纯度达到85%,经测定重组蛋白具有很高的丙氨酸氨基转移酶活性(200 U.mg-1)。结论通过基因克隆及大肠杆菌表达,能得到活性较高的丙氨酸氨基转移酶蛋白。

血小板生成素模拟物研究现状

通过亲和筛选获得的TPO模拟肽和功能筛选获得的非肽类模拟物均具有刺激巨核细胞增殖、成熟和增加血小板数目的功能 ,而且两者体外的生物活性均与TPO相当。这些结果可能为化疗引发的血小板减少症的药物治疗增加新的选择。

献血员戊型肝炎病毒亚临床感染情况调查

目的 了解献血员中戊型肝炎病毒(HEV)亚临床感染情况。 方法 对2002年7～8月向北京市血液中心义务献血的所有人员进行整群抽样,检测抗-HEV IgM和IgG抗体。 结果 北京献血员中抗-HEV IgM阳性率为1.74％,其丙氨酸氨基转移酶(ALT)异常比例高于抗-HEV IgM阴性献血员。ALT异常与HEV相关的比例为2.68％,与HBV相当,但高于丙型肝炎病毒。 结论 献血员中存在HEV亚临床感染者,并且是献血员中ALT异常的原因之一。

中国不同地区商品猪中戊型肝炎病毒感染情况调查

戊型肝炎病毒（HEV）是戊型肝炎（戊肝，HE）的病原体，其基因组结构及病毒形态与杯状病毒科有一定相似之处，但仍有较大差别，因此目前其分类地位尚不明确。戊型肝炎在我国及许多发展中国家均是一种危害严重的急性传染性疾病，其临床表现与甲型肝炎类似，但病死率更高一些，尤其在孕妇中病死率可达20％。

L型变异对结核分枝杆菌耐药性的影响及机制

目的观察L型变异对结核分枝杆菌耐药性的影响。方法将结核分枝杆菌H37Rv细菌型诱导为L型菌株;分离临床标本中的结核分枝杆菌L型菌株。观察结核分枝杆菌L型对一线抗结核药物的敏感性;提取诱导和临床分离的结核分枝杆菌L型菌株的DNA,进行耐药相关基因测序,分析其与结核分枝杆菌L型表型变异的关系。结果诱导结核分枝杆菌标准菌株H37Rv形成的L型对异烟肼、利福平、乙胺丁醇和链霉素均耐药。诱导的L型的基因型与结核分枝杆菌标准菌株H37Rv一致,没有发生改变。临床分离株表现出更为复杂的耐药性。结论结核分枝杆菌L型的表型变异可以造成结核分枝杆菌的耐药性增加,结核分枝杆菌L型的表型变异与其耐药性相关。