超耐热酸性α-淀粉酶基因在多型汉逊酵母中表达及与在毕赤酵母中表达的比较研究

利用毕赤酵母的质粒载体pPIC9K将极端耐热古菌Pyrococcusfuriosus的超耐热酸性α-淀粉酶(Amy)基因转化到多型汉逊酵母HP-6中,获得重组汉逊酵母。经过甲醇进行诱导,表达产物的酶活性检测和SDS-PAGE电泳,证明α-淀粉酶(Amy)在多型汉逊酵母中利用AOX1启动子和α-因子信号肽有效表达并分泌到胞外。该酶的最适反应温度为90～100℃,最适作用pH为4.0～5.0,较之重组毕赤酵母的最适作用pH还低0.5。此外与毕赤酵母的重组蛋白相比,重组汉逊酵母α-淀粉酶不仅菌株筛选简便、周期短,而且具有更容易筛选到高拷贝转化子以及适用于大规模工业发酵等优点。

我国上市公司会计信息质量探究

2014年的南纺股份财务舞弊案,引起了投资者的广泛关注。随着我国会计准则日益与国际趋同,投资者对于上市公司的会计信息质量越来越关注。本文先分析了影响会计信息质量的因素,然后提出了改善会计信息质量的措施,最后加以总结。

雾化吸入干扰素α1b在兔体内的分布及代谢途径

目的研究雾化吸入与肌内注射干扰素α1b(IFNα1b)在兔体内分布及代谢的差异,考察雾化吸入干扰素治疗肺部疾病的优越性。方法将干扰素α1b进行125I标记,选用新西兰大耳白兔,以肌内注射为对照,采用雾化吸入的方式给药,不同时间点取血,γ计数仪测定血药浓度,通过小动物活体成像系统和γ计数仪检测肺组织不同部位的药物分布情况和主要代谢脏器肝和肾中的药物含量。结果与肌内注射比较,雾化吸入给药后肺组织中的干扰素含量更高,肺组织内滞留时间长,血药浓度达峰时间为8 h,明显延迟,而肾组织中的药物含量始终维持较低浓度。结论与常规肌内注射给药相比,雾化吸入干扰素α1b肺组织药物含量高,药物体内循环时间长,是干扰素治疗肺部疾病更为有效的给药途径。

氯胺酮与速眠新Ⅱ复合应用对小型猪麻醉的观察

为探讨氯胺酮与速眠新Ⅱ复合应用对实验小型猪的麻醉效果。将氯胺酮与速眠新Ⅱ等量混合,采用肌肉注射法(0.28mL/kg)对12头实验小型猪(11.33kg±0.83kg)进行复合麻醉,观察麻醉起效时间、麻醉持续时间及镇痛效果,并监测麻醉过程中体温、呼吸、心率等生理指标及有无呕吐、流涎等不良反应。小型猪成功麻醉12例,占100%,肌肉注射后(4.2±1.6)min进入麻醉状态,麻醉状态维持(87.3±15.4)min以上,麻醉期间肌肉松弛效果好,动物呼吸和心率平稳,无不良反应。结果表明,采用氯胺酮与速眠新Ⅱ复合麻醉效果好,麻醉过程平稳,生命体征稳定。氯胺酮与速眠新Ⅱ复合应用是较为简便、安全的小型猪麻醉方法,适合于耗时较长的手术或试验的开展。

集成干扰素突变体Ⅱ的分子构建、表达及提纯

目的:通过定点突变,构建集成干扰素突变体Ⅱ(IFN-Con-m2),以期获得兼具高效作用和可定点聚乙二醇(PEG)修饰的新型药物分子。方法:采用PCR体外定点突变技术,使集成干扰素突变体Ⅰ(IFN-Con-m1)基因的第86位密码子由TAC突变为TGC。将扩增片段克隆入pET-23b表达载体,重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)。IPTG诱导后,表达的IFN-Con-m2经包涵体变复性、疏水层析、DEAE层析和凝胶过滤层析等纯化后,用WISH-VSV系统进行生物活性测定。结果:IFN-Con-m2以包涵体形式表达,表达量占菌体总蛋白的30%以上。纯化后,IFN-Con-m2的纯度大于95%,比活性大于5.0×108IU/mg。结论:构建了IFN-Con-m2的表达载体,并成功地在大肠杆菌中表达,获得了高活性突变分子IFN-Con-m2,建立了IFN-Con-m2的纯化工艺。

聚乙二醇定点修饰集成干扰素突变体Ⅱ

目的:用聚乙二醇(PEG)修饰集成干扰素突变体Ⅱ(IFN-Con-m2,IIFNm2),通过纯化获得新型修饰分子并对该分子进行抗胰蛋白酶水解稳定性及初步药代动力学研究。方法:将mPEG20000定点偶联到IIFNm2的第86位Cys残基上,修饰后的产物经CM层析后,以SDS-PAGE考察其纯度,用WISH-VSV系统进行生物活性测定;在0.1%胰蛋白酶条件下考察体外抗酶解稳定性;并以SD大鼠进行初步药代动力学研究,绘制血药浓度-时间曲线。采用3P87软件进行数据拟合,分析药物动力学参数。结果:干扰素修饰率约为50%,且绝大多数以单修饰体(mono-PEG-IIFNm2)形式存在;提纯后mono-PEG-IIFNm2的纯度大于98%,比活性约为修饰前IIFNm2的1%。抗胰蛋白酶水解试验表明:30min后,IIFNm2抗病毒活性残留为8%,mono-PEG-IIFNm2为41%。初步药代动力学研究显示:IIFNm的消除半衰期为(1.57±0.34)h,mono-PEG-IIFNm2为(18.0±4.0)h。结论:成功地偶联了PEG和IIFNm2,建立了mono-PEG-IIFNm2的纯化工艺,PEG修饰能增加IIFNm2的体外抗胰蛋白酶水解稳定性,并显著延长体内半衰期。

重组人干扰素α1b喷雾剂皮肤局部药代动力学研究

本试验旨在考察重组人干扰素α1b喷雾剂在皮肤应用的局部药代动力学特性,分别在小型猪完整皮肤、通透性增强皮肤和破损皮肤上进行透皮吸收研究。采用1、3、5及25μg/mL重组人干扰素α1b喷涂于受试部位,在用药后0、1、2、4h分别取用药部位皮肤组织制成匀浆,检测匀浆中干扰素活性。药物可渗透进入小型猪完整皮肤;在小型猪通透性增强和破损皮肤中,用药4h内,药物可达到有效治疗浓度;用药剂量和用药时间与皮肤组织中药物活性相关,不同剂量组间和不同检测时间组间差异显著(P<0.05)。5μg/mL重组人干扰素α1b喷雾剂间隔4h用药可在用药局部起到抗病毒作用。

人sApo2L-Fc的分子构建及其在CHO细胞中的表达

目的:构建人sApo2L-Fc分子,在中国仓鼠卵巢细胞(CHO)中表达有生物学活性的人Apo2L-Fc融合蛋白。方法:将sApo2L-Fc基因克隆入pcDNA3.1(+)表达载体,重组质粒转化大肠杆菌DH5α。挑取阳性克隆扩大培养,提取质粒进行酶切鉴定;采用脂质体法将重组质粒转入CHO细胞,经G418加压筛选、ELISA检测,挑选表达较高的阳性转化子扩大培养;表达的sApo2L-Fc融合蛋白经Protein A亲和柱纯化,纯化产物用SDS-PAGE,Western blotting检测样品的分子量及免疫原性,用L929细胞进行生物活性测定。结果:酶切鉴定及测序显示重组子构建与预想一致;ELISA证实了sApo2L-Fc融合蛋白在CHO细胞中的表达;SDS-PAGE检测到纯化产物的分子量与理论分子量相符;在同样的位置,Western blotting显示阳性;L929细胞测定:纯化产物的生物学活性达1.0×105IU/mg。结论:构建了sApo2L-Fc的表达载体,并成功地在CHO中表达,表达的sApo2L-Fc融合蛋白具有生物学活性。

应用高效液相色谱法定量检测重组人干扰素α1b

目的 寻找一种快速检测重组人干扰素α1b含量的方法。方法 采用美国Waters 600型高效液相色谱仪,选用Protein-Pak125 7.8mm×300mm柱,以25mmol/L pH7.0磷酸缓冲液为流动相,流速为1ml/min,检测吸收波长为280nm,以外标法按峰面积计算回收率。结果 平均回收率为95％,s=2.9％。结论 高效液相色谱法可以用于检测重组人干扰素α1b的含量,而且灵敏度高,结果准确。

重组人干扰素α1b空间诱变菌种初步筛选研究

目的利用"神舟八号"飞船对表达重组人干扰素α1b的基因工程菌株进行空间诱变,通过菌种筛选,获得高表达目的产物的菌株。方法对重组人干扰素α1b空间搭载菌种进行平板分离、抗性平板初筛和试管复筛,进行诱导表达,通过2轮SDS-PAGE分析获取高产菌株。结果首先从300个克隆中筛出221株阳性克隆,再从194个表达重组人干扰素α1b单克隆中筛选到144株具有氨苄青霉素抗性的克隆;通过等量接种和小量试管表达,最终筛选到6株目的蛋白表达量和表达比例较高的克隆。结论通过初步筛选,获得6株空间诱变后较高表达的重组人干扰素α1b生物工程菌菌株。

靶向血管内皮生长因子及其受体的抗肿瘤药物研究进展

血管生成对肿瘤的生长和转移起着关键作用,血管内皮生长因子(VEGF)及其受体信号通路是调节肿瘤新生血管生成的重要途径,因此,近年来以VEGF及其受体为作用靶标的抗肿瘤血管生成治疗已经成为研究热点,目前已有多种药物上市或处于临床试验阶段。本文主要综述了VEGF及其受体在肿瘤血管生成调节机制中的作用,同时着重介绍靶向VEGF及其受体的抗肿瘤药物的新近研究进展、临床应用及存在的问题。

重组超耐热酸性α-淀粉酶的分离纯化及其性质研究

基因工程菌所产生的重组超耐热酸性α-淀粉酶,通过超滤浓缩、脱盐和聚丙烯酰胺垂直板凝胶电泳进行纯化,得到电泳纯的超耐热酸性α-淀粉酶,纯化倍数为11.7,活力回收率为29.8%。用SDSPAGE测得该酶的分子量为55kD,酶的等电点pI(室温)为5.0,以可溶性淀粉为底物的Km值为1.12gL,用硫酸酚法测得其含糖量为15.4%。该酶的最适反应温度为95℃,最适反应pH值为4.5。在pH4.0～7.0室温放置48h酶活没有变化,110℃保温1h残留60%活力。Cr3+、Fe2+、Cu2+抑制酶的活性,Ca2+对酶活无影响。EDTA和DTT对酶的活性无影响。

干扰素产品现状及市场前景

干扰素产品现状及市场前景吴美英程永庆（北京三元基因工程有限公司）干扰素系统是一种重要的细胞功能调节系统。干扰素具有广谱的抗病毒，抗细胞分裂，免疫调节等多种生物活性。它是一种重要的抗病毒、抗肿瘤治疗药物［１］。干扰素的种类很多，有人体干扰素，动物干扰素...

重组人干扰素α_1b层析工艺中内毒素的去除

目的通过检测评价重组人干扰素α1b各步层析工艺中内毒素的去除情况,为工艺验证提供参考。方法重组人干扰素α1b层析工艺采用DEAE Sepharose FF离子交换层析、单抗Sepharose-4B亲和层析和Sephacry-S100凝胶过滤层析。采用鲎试剂法检测层析各阶段产物中的内毒素含量,计算内毒素去除率。结果每步层析均有去除内毒素的作用,以亲和层析去除内毒素作用最强。最终所得蛋白的内毒素含量降至0.7EU/1mg以下,总去除率达到99.9999%。结论生产重组人干扰素α1b所用分离纯化层析技术在纯化蛋白的同时能有效去除产品中的内毒素,所得最终产品的内毒素含量远低于药典对注射剂的内毒素含量要求。

探讨医院药学管理的发展

在医院的工作中,药学管理有着非常重要的作用。当今社会在不断进步,人们对于服务的需求越来越高,各行各业的服务理念在不断提升,医院药学管理也在持续拓展。虽然,当前医药管理工作遇到了许多的麻烦,但是只要医务人员不断努力,不断提升自己各方面的能力,就可以推动医院药学管理工作持续发展。

关于抗生素滥用问题的思考

分析抗生素使用的一些禁忌问题,对滥用抗生素原因等进行分析,找出其中存在的主要影响因素,进而采取一系列有效措施加以防范和控制。

基于处方药品专业化学术推广的优化策略分析

目的为医药企业专业化学术推广提供优化策略。方法通过阐述和具体分析处方药品现有的专业化推广模式,结合相关调查数据,以定性和因子分析定量的方法进行分析对比。结论在现有的专业化学术推广过程中,应着重加强与科室医生的交流联系以及邀请行业权威开展不同类型的学术会议。

胃滞留缓释片的研究进展

研究胃滞留缓释片类型和特点,并结合近年来国内外在胃滞留缓释片体内外评价方法进行了分析,总结了该药物在未来的发展前景。

生物制品用内包材微生物限度检测方法的验证

目的建立生物制品用内包材（中性硼硅玻璃管制注射剂瓶、药用卤化丁基橡胶塞和抗生素瓶用铝塑组合盖）微生物限度检查方法,并进行验证。方法采用薄膜过滤法检查上述3种内包材的微生物限度,并按照验证试验方法,在供试品中加入5种标准菌,测定其回收率。结果金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌、白色念珠菌和黑曲霉5种标准菌在上述3种内包材供试品溶液中的平均回收率均为70%-110%,符合公示的2015年版药典中要求的50%-200%的标准。结论薄膜过滤法适用于上述3种内包材的微生物限度检验。

Fab类抗体的研究进展

在基因工程抗体中,Fab类(Fabs)抗体有许多优势,如相对分子质量小、组织分布特异性强和免疫原性低等,使Fab类抗体成为近几十年来的研究热点。除了应用较广泛的体外酶消化法外,多种表达系统(如大肠杆菌和昆虫等)皆用于Fab类抗体的获得,其中大肠杆菌表达的系统研究最为彻底,且已经应用于制备Fab类临床药物。目前已经有赛妥珠单抗等6种Fab类抗体药物通过了美国FDA申请并上市,并有多种Fab类药物正处于临床试验阶段。本文分别对Fab类抗体的基本结构及特点、Fab类抗体的生成、表达和提高产量的策略、临床应用的研究进展进行介绍。