抑制自噬增敏天花粉蛋白诱导HeLa细胞凋亡的作用机制研究

探讨天花粉蛋白(trichosanthin,TCS)诱导宫颈癌HeLa细胞发生细胞自噬和凋亡的作用和机制。两步层析法制备TCS,MTT法检测TCS抑制HeLa细胞的增殖情况;透射电镜下观察TCS处理HeLa细胞后自噬囊泡和凋亡小体的形成;激光共聚焦显微镜下观察绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP)-自噬微管相关蛋白轻链β3(microtubule-associated protein 1 light chain beta 3,LC3B)融合蛋白定位的改变;Western blot检测细胞自噬和凋亡相关蛋白表达的变化情况。研究发现制备的TCS纯度高,且具有生物学活性。TCS能明显抑制宫颈癌HeLa细胞的增殖,且呈浓度和时间依赖性。透射电镜下观察TCS作用12 h后有明显的自噬囊泡形成,48 h后有典型的凋亡小体形成。激光共聚焦显微镜下观察到LC3B蛋白在胞浆中由弥散分布转向斑点状聚集分布。Western blot结果显示,TCS处理HeLa细胞12 h后自噬活化蛋白LC3BⅡ表达开始升高,且随药物浓度的增加而增加。TCS作用24 h后凋亡相关蛋白多腺苷二磷酸多聚酶(poly ADP-ribose polymerase,PARP)开始出现活性剪切带,TCS与3-甲基腺嘌呤(3-methyladenine,3-MA)联用后进一步促进PARP的剪切活化。结果表明,TCS能明显抑制宫颈癌HeLa细胞的生长,诱导HeLa细胞发生自噬和凋亡,且TCS诱导的HeLa细胞自噬早于凋亡,抑制自噬能够增敏天花粉蛋白诱导的HeLa细胞凋亡,表明TCS诱导的细胞自噬是一种保护性细胞反应,与自噬抑制剂联用可增强TCS的抗宫颈癌作用。