肝窦内皮细胞损伤和表型改变在大鼠肝硬化门脉高压发生中的作用

目的:探讨肝窦内皮细胞(SECs)损伤和表型改变与大鼠肝硬化门脉高压的关系。方法:采用二甲基亚硝胺(DMN)4周12次腹腔注射复制大鼠肝硬化模型,分别于造模后1d、2d、3d、1周、2周、4周、6周、8周作动态观察;肠系膜前静脉分支插管法测门脉压力(Ppv);透射电镜观察肝组织超微结构;免疫组化观察肝窦壁CD44和Ⅷ因子相关抗原(vWF)表达;Northernblot检测肝组织内皮素-1(ET-1)mRNA和内皮型一氧化氮合酶(eNOS)mRNA表达;Westernblot检测肝组织eNOS表达;放射免疫法测定血清透明质酸(HA)和肝组织ET-1含量。结果:DMN造模1d后CD44染色明显弱于正常对照组(P<0.05),SECs窗孔减少,血清HA含量显著高于正常对照组(P<0.05);DMN造模2d后vWF阳性染色明显强于正常对照组(P<0.05);DMN大鼠的Ppv与肝窦壁vWF表达量和血清HA含量呈显著正相关(P<0.05);造模2d和3d时ET-1mRNA表达强于正常对照组,ET-1含量轻度高于正常对照组;造模1d、2d和3d时eNOSmRNA表达强于正常对照组,而eNOS一直呈低水平状态。结论:SECs损伤和表型改变是DMN大鼠肝硬化门脉高压形成的病理基础之一;ET-1和NO产生的平衡失调,使肝内血流阻力增加,在门脉高压形成过程中起重要作用。

二甲基亚硝胺大鼠肝纤维化形成中门脉压力的动态变化

目的:探讨二甲基亚硝胺(DMN)肝纤维化大鼠门脉压力(Ppv)的动态变化及门脉高压形成的病理组织学基础。 方法:DMN 4 wk12次腹腔注射制作大鼠肝纤维化模型,分别于造模后1、2、4、6和8wk启肠系膜前静脉插管直接测定Ppv,获取肝组织光镜下观察病理学变化,Jamall法测定肝组织羟脯氨酸含量。 结果:造模开始后不同时期大鼠Ppv(kPa),模型大鼠/正常大鼠如下:1 wk:1.48±0.11/1.17±0.12,P<0.05;2 wk∶1.48±0.42/1.01±0.03,P>0.05;4 wk∶1.97±0.19/0.90±0.01,P<0.01;6wk∶1.65±0.23/0.80±0.08,P<0.01;8 wk∶1.15±0.24/0.92±0.05,P>0.05。肝组织学观察,1 wk时可见肝细胞肿胀,少量出血,窦壁细胞增生,肝窦充血,2 wk时肝细胞肿胀、出血性坏死较重,有较粗的纤维间隔向肝小叶伸展。4 wk时可见大面积出血性坏死,汇管区明显增宽,窦壁细胞增生显著,有大量的长梭形细胞附着,窦壁增厚,肝窦甚至扭曲;闭塞。6 wk时窦壁细胞增生较4 wk时减轻,8 wk时肝窦组织结构趋向恢复正常,但6wk、8wk的纤维化仍较显著;模型大鼠的Ppv与肝组织Hyp含量无显著相关性(P>0.05)。 结论:门脉高压是DMN肝纤维化大鼠的显著特征之一,肝窦壁病理变化是该模型门脉高压形成的主要组织学基础。

肝纤维化过程中整合素α5β1动态变化与扶正化瘀方干预作用

目的 探讨肝纤维化形成过程中整合素α5 β1蛋白的变化特点 ,及其扶正化瘀方影响该蛋白表达的抗肝纤维化作用机制。方法 四氯化碳 (CCl4)皮下注射与高脂低蛋白饲料复合建立大鼠肝纤维化模型。 13 5只大鼠分为正常组、模型组与扶正化瘀方药物干预组。模型组又分为 2d、1、2、3、4、5、6周共 7个动态观察点。药物组自造模之日起以扶正化瘀方稀释液灌胃 ,共用药 6周。其余大鼠灌以等量生理盐水。天狼猩红染色观察肝组织胶原沉积 ,盐酸水解法测定肝组织羟脯氨酸含量 ,Western印迹法分析肝组织纤维连接蛋白 (FN)、α5 β1与α 平滑肌肌动蛋白 (α SMA )表达量 ,并分析其相关性。结果 随肝纤维化形成 ,模型组大鼠肝组织FN、α5 β1与α SMA蛋白表达量逐渐上升 ,早期以FN升高明显 ,而后以α5 β1及α SMA增加较为显著 ,三者之间呈明显正相关。与模型组比较 ,扶正化瘀方预防组大鼠肝脏胶原沉积减轻 ,肝羟脯氨酸含量下降 ,FN、α5 β1与α SMA蛋白表达减少。 结论 CCl4大鼠肝纤维化形成中肝脏整合素α5 β1表达逐渐增加 ,肝损伤早期FN显著上升 ,并可通过α5 β1促进肝星状细胞活化与肝纤维化。扶正化瘀方抑制肝纤维化大鼠肝脏FN与整合素α5 β1表达 。

γ-干扰素对大鼠二甲基亚硝胺肝纤维化肝脏胶原代谢的作用

目的:探讨γ-干扰素(interferon-γ,IFN-γ)影响肝脏胶原代谢的抗肝纤维化作用机制。 方法:二甲基亚硝胺腹腔注射诱导大鼠肝纤维化模型,以IFN-γ5万U/只,im,bid,共4wk。观察大鼠的体质量、肝脾重质量等一般情况.大鼠肝脏HE染色与丽春红胶原染色,分级分期观察肝组织的炎性坏死与胶原纤维沉积变化。检测大鼠血清肝功能与肝组织羟脯氨酸含量,分析肝组织间质型胶原酶(interstitial collagenase,MMP-1)活性,检测肝组织Ⅰ型前胶原[α_1(1)]基因表达。 结果:模型大鼠肝脏胶原纤维间隔形成,肝小叶与肝窦内胶原增生沉积明显;脾脏明显增大;血清ALT活性升高;肝组织羟脯氨酸含量上升,MMP-1活性轻度上升,Ⅰ型前胶原基因表达明显增多。与模型对照组比较,γ-干扰素可显著降低模型大鼠肝组织羟脯氨酸含量(29.8±11.0μg·g^(-1),vs 44.7±14.2μg·g^(-1),P<0.05),减轻肝脏内胶原纤维增生沉积,降低血清ALT活性(478.4±156.4nkat·L^(-1),vs 1055.2±128.4 nkat·L^(-1),P<0.05),提高肝组织MMP-1活性(39.8±6.5 U,vs 32.0±2.8 U,P<0.05),降低Ⅰ型前胶原基因表达(84.8±9.5％,vs 112.3±8.7％,P<0.05)。 结论:IFN-γ有良好的治疗二甲基亚硝胺诱导的大鼠肝纤维化效果,其作用机制主要在于纠正纤维化肝脏异常胶原代谢。

大鼠肝纤维化形成中基质金属蛋白酶2、9活性变化的病理意义

目的 探讨大鼠肝纤维化形成中基质金属蛋白酶2、9(MMP—2、MMP—9)活性变化及其病理意义。 方法 采用二甲基亚硝胺4周12次腹腔注射制作大鼠肝纤维化模型,分别于造模后1、2、3 d、1、2、4、6、8周作为动态观察时相点;MMP—2和MMP—9活性测定采用酶谱法,透射电镜观察肝组织超微结构,免疫组织化学观察肝窦壁Ⅳ型胶原(C Ⅳ)、层黏连蛋白(LN)和Ⅰ型胶原(C Ⅰ)表达,western blot方法测定肝组织金属组织蛋白酶抑制剂—2(TIMP—2)含量。 结果 造模后第2、3天,MMP—2、MMP—9活性(灰度值)显著增加(2 d:MMP—2正常对照组为54.72±4.56,模型组为70.76±7.63,F=16.27,P<0.05;MMP—9分别为25.71±4.29和51.76±15.33,F=13.38,P<0.05)。肝窦壁C Ⅳ(阳性面积比％)在造模第2、3天直至1周显著减少(2 d:正常对照组为6.06±1.35,模型组为2.86±0.63,F=69.12,P<0.05),4周末则显著增加(正常对照组为6.06±1.35,模型组为8.04±1.50,F=14.42,P<0.05)。MMP—9活性与肝窦壁C Ⅳ表达量呈显著负相关(F=—0.729,P<0.05);肝窦壁LN沉积4周末达峰值;正常肝窦壁无C Ⅰ表达,造模4周后肝窦壁C Ⅰ呈阳性染色;4周模型大鼠可见完整的基底膜形成;肝纤维化后期TIMP—2表达异常增加。 结论 早期MMP—9(主要的)、MMP—2活性升高,降解肝窦内皮细胞?

肝窦毛细血管化在二甲基亚硝胺大鼠肝纤维化门静脉高压形成中的作用

目的 研究肝窦毛细血管化在二甲基亚硝胺(DMN)大鼠肝纤维化门静脉高压形成中的作用。方法经4周12次腹腔注射DMN制备火鼠肝纤维化模型,应用电镜技术、免疫组织化学方法结合大鼠门静脉压力测定,24周动态分析肝纤维化形成过程中肝窦毛细血管化与门静脉压力变化的相关性。结果 大鼠门静脉压力随着造模的进行不断升高,造模4周时达(1.10 ±0.18)kPa,明显高于对照组(0.52±0.04)kPa(t=6.41.P<0.0 1)。造模停止后,大鼠门静脉压力逐渐恢复正常。其动态变化与电镜下肝窦毛细血管化的变化规律一致;与反映肝窦内皮表型改变的第Ⅷ因子相关抗原的动态变化成正相关(r=0.833,P<0.01);与反映肝窦内皮下基底膜形成的层黏连蛋白的动态变化成正相关(r=0.953,P<0.01);与反映肝窦壁星状细胞活化收缩的α-平滑肌肌动蛋白的动态变化成正相关(r=0.919,P<0.01)。结论 肝窦毛细血管化是DMN肝纤维化模型门静脉高压产生的主要原因。

肝星状细胞活化在大鼠肝硬化门脉高压形成中的作用

[目的]探讨肝星状细胞(HSC)活化在大鼠肝硬化门脉高压形成中的作用。[方法]采用二甲基亚硝胺(DMN)4周12次腹腔注射制作大鼠肝硬化模型,分别于造模后1d、2d、3d、1周、2周、4周、6周、8周作为动态观察时相点,免疫组化染色观察肝组织α平滑肌肌动蛋白(αSMA)、Ⅳ型胶原(ColⅣ)、层黏连蛋白(LN)表达,电镜观察肝组织超微结构,肠系膜前静脉分支插管法测门脉压力(Ppv)。[结果]造模2、3d后肝窦壁αSMA染色逐渐增强,4周时阳性表达最为明显;模型大鼠肝窦壁ColⅣ阳性染色呈现先弱后强,LN的沉积随造模时间的延长而进行性增加,4周时表达最为明显,电镜下可见肝窦内皮失窗孔和基底膜形成;DMN大鼠HSC中αSMA表达量与Ppv高低呈显著正相关(P<0.05)。[结论]活化的HSC通过分泌大量的ColⅣ和LN形成肝窦内皮下基底膜以及因表达αSMA而收缩力增强,是肝硬化肝窦阻力增加和门脉高压形成的重要病理细胞学基础。