中药体外肝肾细胞毒性评价的研究进展

就近几年一些中药通过肝肾细胞模型在体外评价其毒性方面的应用情况进行概述,并对中药体外肝肾毒性评价方法的应用前景进行展望。

蛋白质组学技术在药物性肝损伤生物标志物研究中的应用

临床前药物性肝损伤的评价存在灵敏性低和特异性差的问题,常产生假阴性结果和出现意外的毒性,是导致药物终止开发甚至退市的重要原因之一。在药物肝毒性临床前研究中,可以利用蛋白质组学技术的快速、灵敏、高通量等优点,寻找和发现新的肝毒性生物标志物,使药物开发过程更为安全有效。本文对肝毒性生物标志物的研究现状,蛋白质组学在生物标志物的发现及验证等方面的技术发展进行了综述分析,并且着重归纳了该技术在中药致肝损伤方面的生物标志物研究中的应用。与传统评价方法相比,蛋白质组学技术对于发现新型肝潜在毒性生物标志物具有不可替代的优势。随着蛋白质组学技术结合其他组学技术的发展,其在药物肝毒性早期筛选、生物标志物的临床桥接等方面将取得突破性的进展。

麝香保心丸安全性研究概述

通过查阅文献、分析现有研究资料,将麝香保心丸的安全性研究归纳为毒理学研究、临床安全性研究及配伍减毒机制研究三部分进行阐述及评估。毒理学实验提示注意监测女性患者的凝血指标和甘油三酯水平。麝香保心丸临床应用不良反应发生率低,长期服用可耐受。蟾酥通过干扰能量代谢等通路产生心脏毒性,含等剂量蟾酥的麝香保心丸不会出现上述通路。麝香保心丸是一种安全的治疗冠心病、心绞痛的药物,且长期用药安全可耐受。

药物性肝损伤新型生物标志物的研究进展

药物性肝损伤(drug induced liver injury,DILI)作为新药研发关注的重点,是药物临床前安全性评价和临床研究的难点,也是国内外肝病研究的热点。传统的肝损伤指标因灵敏性和特异性等因素,限制了其在DILI早期评价中的应用。因此,寻找及验证新的DILI生物标志物已成为近年来新药研究及临床诊断关注的焦点。本文从血清酶学、细胞因子、基因组学、蛋白质组学、代谢组学等方面,对当前具有代表性的新型DILI生物标志物进行综述,以期为DILI的预测和诊断,以及药物安全性评价提供参考。

代谢组学在药物性肝损伤研究中的应用

药物性肝损伤是临床常见的药物不良反应,也是导致药物终止开发甚至退市的重要原因之一,它会导致内源性代谢物成分和含有量的异常。通过代谢组学技术对内源性代谢产物的整体系统分析,为寻找早期药物性肝损伤生物标志物、毒性机制的探索等方面提供新的技术方法。故本文对近年来代谢组学在药物性肝损伤标志物筛选、肝损伤机制及损伤修复等方面的应用进展进行了综述。

川楝子致大鼠肝毒性机制研究

目的:研究川楝子对大鼠SOD,MDA,γ-GT,GSH-Px及炎症因子TNF-α,NF-κB,ICAM-1等的影响,探求川楝子致大鼠肝脏损害的毒性机制。方法:SD大鼠,连续给药45 d后,取正常组及川楝子(120 g.kg-1组)大鼠肝组织,制成10%肝匀浆,按试剂盒方法测定肝组织中超氧化物歧化酶SOD,MDA活性和γ-GT,GSH-Px,蛋白含量,并根据测得SOD与MDA计算SOD/MDA;采用双抗体夹心ABC-ELISA法测定大鼠肝组织TNF-α含量;采用免疫组织化学SABC法染色测定大鼠肝组织NF-κB p65,ICAM-1蛋白表达量。结果:与正常组比较,口服川楝子120 g.kg-145 d后,大鼠肝组织SOD显著下降(P<0.01),MDA显著上升(P<0.05),SOD/MDA显著下降(P<0.01);γ-GT值显著上升(P<0.01),GSH-Px显著下降(P<0.01);TNF-α含量升高(P<0.05);NF-κB p65,ICAM-1阳性表达明显增强(P<0.01)。结论:大鼠灌胃给予川楝子后,可对肝脏产生明显的毒性,其机制可能与自由基及炎症因子有关。

白芍对川楝子减毒作用机制研究

目的:通过配伍中药白芍考察对川楝子的减毒效应及其机制,以探求减轻川楝子肝毒性的中药复方减毒配伍规律。方法:SD大鼠,分组,单次灌服蒸馏水或川楝子、川楝子+白芍,放射免疫法检测肿瘤坏死因子(TNF-α)、白细胞介素-6(IL-6)含量、免疫组化法检测核转录因子-κB(NF-κB)、ICAM-1蛋白表达。Western-blot法检测caspase-3、bcl-2基因表达。结果:白芍与川楝子配伍应用后,能够对抗肝组织TNF-α、IL-6水平的提高(P<0.05或P<0.01),能对抗肝组织NF-κB、ICAM-1蛋白表达的增强(P<0.01);能够调节肝组织caspase-3、bcl-2的基因表达。结论:白芍能对抗川楝子导致的肝损伤,其减毒机制是该药可以减轻肝组织炎症反应,并与调节肝细胞坏死相关基因caspase-3、Bcl-2的表达有关。

基于1H-核磁共振代谢组学研究黄药子乙醇提取物致肝损伤的潜在生物标志物

目的采用基于1H-核磁共振（NMR）的代谢组学方法,分析黄药子乙醇提取物（RDB）致肝损伤大鼠血清和尿液中代谢产物随时间的动态变化,探寻RDB肝毒性早期的潜在生物标志物。方法大鼠ig给予RDB5 g·kg-1,连续给药28 d,于给药后3,7,14和28 d及停药后7 d（恢复期）取6只大鼠采血,进行常规血液生化分析;取肝组织,计算肝指数,并用HE染色进行肝组织病理观察。收集给药后0,3,7,14和28 d及停药后7 d血清和尿液,进行1H-NMR的代谢组学研究,采用主成分分析和正交偏最小二乘法分析对早期潜在生物标志物进行筛选和鉴别。结果与正常对照组相比,RDB组血清总胆红素（TB）和总胆固醇（TC）于给药后3~28 d显著升高（P〈0.05）,总胆汁酸（TBA）于7~28 d显著升高（P〈0.05）,TB,TC和TBA于停药后7 d恢复正常,谷丙转氨酶和谷草转氨酶活性以及葡萄糖含量均无显著变化。RDB组给药后肝指数显著升高（P〈0.01）,停药后7 d恢复正常;肝组织于给药后7 d开始出现单细胞坏死和肝细胞肿大,随给药时间延长,病变程度加重;停药7 d后有所恢复。代谢组学检测显示,RDB给药早期血清脂质〔低密度脂蛋白（LDL）/极低密度脂蛋白（VLDL）〕、谷氨酸、磷酸胆碱和甘油磷酸胆碱等升高（P〈0.05）,尿液丙酮酸盐和N-乙酰谷氨酸等降低（P〈0.05）;上述代谢产物在停药7 d后均恢复正常。结论早期肝损伤与糖脂代谢、能量代谢和胆汁淤积有关。随着RDB给药的持续,产生了组织过氧化损伤。线粒体损伤导致体内能量代谢不足。血清脂质（LDL/VLDL）、谷氨酸、磷酸胆碱和甘油磷酸胆碱,及尿液丙酮酸盐和N-乙酰谷氨酸均可作为RDB致肝损伤的早期潜在生物标志物。

基于药代动力学的山豆根抗炎作用机制研究

目的基于药代动力学研究山豆根对角叉菜胶致大鼠足跖肿胀模型的抗炎作用及机制。方法雄性SD大鼠分为空白对照组、氢化可的松组(40 mg·kg^-1)、山豆根水提浸膏粉高剂量组(生药0.6 g·kg^-1)和低剂量组(生药0.3 g·kg^-1),测定致炎前和致炎后0.5、1、2、和3 h足跖肿胀度、致炎组织中炎症因子TNF-α、IL^-1β和IL-6含量及血中苦参碱、氧化苦参碱药代动力学参数。结果氢化可的松组致炎后肿胀率明显降低(P<0.01),山豆根水提浸膏粉组致炎后肿胀率亦降低(P<0.05)且体内苦参碱含量呈剂量依赖性,高剂量组AUC值约为低剂量组两倍,达峰时间与抗炎作用高峰时间一致;山豆根水提浸膏粉可显著下调炎症因子含量(P<0.01),抑制其表达的作用呈剂量依赖性。结论山豆根对角叉菜胶致大鼠足跖肿胀模型具有抗炎作用,且呈剂量依赖性,与体内苦参碱系统暴露量成正相关,抗炎机制与抑制炎症因子表达有关。

薄荷油致小鼠肝毒性时-量关系及其机理研究

目的研究薄荷油致小鼠肝毒性的量效、时效关系及自由基损伤机制。方法小鼠口服不同剂量薄荷油，测定其LD50。另取小鼠按不同剂量或不同时间点分组，检查血清ALT等肝功能指标和肝组织形态变化，测定肝组织SOD，MDA。结果小鼠口服薄荷油的LD50为3．0ml／kg。ALT等肝功能指标在给药后24—48h达到高峰，72h可恢复近正常值。与正常组相比，薄荷油中、高剂量组对肝组织损伤显著，随着剂量增大，ALT等肝功能指标升高显著（P〈0．05或P〈0．01）。薄荷油组与正常组比较，小鼠肝组织中SOD降低而MDA升高（P〈0．05），与四氯化碳相似。结论小鼠一次性口服大剂量薄荷油可造成急性肝损伤甚至死亡，并显示有毒性时-效、量-效关系；自由基损伤可能是其肝毒性机制之一。

吴茱萸水煎液对大、小鼠肝药酶亚型影响的比较研究

目的比较吴茱萸水煎液对大鼠、小鼠肝药酶亚型的影响。方法取KM小鼠随机分为吴茱萸高剂量组(56 mg生药·g-1)、低剂量组(28 mg生药·g-1)和正常组,另取Wistar大鼠随机分为吴茱萸高剂量组(40 mg生药·g-1)、低剂量组(20 mg生药·g-1)和正常组,连续灌胃给予吴茱萸水煎液或等容量蒸馏水21 d后,采用药物探针法测定动物肝药酶亚型CYP1A、CYP2C、CYP2D、CYP2E1、CYP3A的活性。结果①小鼠实验结果显示,与正常组比较,吴茱萸高、低剂量组均诱导肝药酶亚型CYP1A、CYP2E1和CYP3A的活性(P<0.01),低剂量组诱导CYP2C活性(P<0.05);吴茱萸高、低剂量组对CYP2D活性无明显影响。②大鼠实验结果显示,与正常组比较,吴茱萸高、低剂量组均诱导肝药酶亚型CYP1A活性(P<0.01)。高剂量组诱导CYP2C和CYP2E1活性(P<0.05或0.01);吴茱萸高、低剂量组对CYP3A活性无明显影响;吴茱萸高、低剂量组均抑制CYP2D活性(P<0.01)。③实验结果对比显示,吴茱萸水煎液对大、小鼠肝药酶亚型的影响相同点是诱导了CYP1A、CYP2C及CYP2E1活性,尤其对CYP1A活性诱导更为明显。不同点是吴茱萸诱导了小鼠CYP3A活性,而对大鼠CYP3A活性无明显影响;吴茱萸对小鼠CYP2D活性无明显影响,而对大鼠CYP2D活性有明显抑制作用。结论吴茱萸水煎液对大、小鼠部分肝药酶亚型活性的影响有一定的差异性。

川楝子对大鼠肝毒性的时效和量效关系研究

目的观察川楝子对大鼠肝脏损害的毒性时效、量效关系。方法取大鼠按不同时间（1、2、6、12和24h。剂量为90g/kg）及不同剂量（30.6、62.6和127.5g/kg）分组,单次灌胃给予川楝子,观察给药后大鼠外观、行为有无异常改变。处理时动物称重,摘取肝脏、脾脏和胸腺,计算脏器指数;检测大鼠血清丙氨酸转氨酶（ALT）、天冬氨酸转氨酶（AST）活力;光学显微镜下观察肝组织的病理变化。结果川楝子以90g/kg灌胃1-2h后多数大鼠出现活动减少,给药6h后脾指数下降,12h后的胸腺指数下降,与正常组比较差异有统计学意义（P〈0.05）;大鼠灌胃川楝子后,血清ALT,AST活力在2h时达到高峰（P〈0.05,P〈0.01）,持续时间约为24h;光学显微镜下,川楝子给药组在不同时间点均有不同程度的肝细胞水肿或脂肪变性。川楝子以62.6、127.5g/kg灌胃2h后,脏器指数未见明显改变,ALT活力较高,与正常组比较差异有统计学意义（P〈0.01）;光镜下,给药组不同剂量出现不同程度的肝细胞水肿、轻度脂肪变性,肝细胞点状坏死,其中127.5g/kg剂量组病理改变与正常组比较,差异有统计学意义（P〈0.05）。结论大鼠单次灌胃给予川楝子后的肝脏毒性在2h达到高峰,且随着剂量增加,其肝毒性反应逐渐增强,显示有毒性时效、量效关系。

苦参碱和氧化苦参碱致HL7702细胞毒性研究

目的：探讨苦参碱和氧化苦参碱在体外对人正常肝细胞（HL7702）的影响。方法：①采用MTT法检测苦参碱和氧化苦参碱对肝细胞活力的影响;②采用光镜对给药后的细胞形态进行观察;③检测给予苦参碱和氧化苦参碱后,肝细胞培养上清液中的肝功能指标（ALT、AST、ALP、LDH）。结果：①MTT法显示,2.5~5mg/mL的苦参碱对HL7702细胞有明显的抑制作用（P〈0.01）,5mg/mL的氧化苦参碱能够显著性降低肝细胞活力（P〈0.05）;②光镜结果显示,给予苦参碱和氧化苦参碱后,细胞出现皱缩,变圆,体积变小,亮度增加,且药物浓度越大,呈现此状态的数目越多,苦参碱对HL7702细胞形态的影响大于氧化苦参碱;③5mg/mL的苦参碱和氧化苦参碱均能明显升高细胞上清液中的AST、ALP、LDH水平（P〈0.01或P〈0.05）,相同剂量苦参碱的上清液中AST、ALP、LDH水平的升高程度大于氧化苦参碱。结论：苦参碱和氧化苦参碱对肝脏可能具有毒性作用,且苦参碱的肝毒性作用大于氧化苦参碱。

大鼠皮肤类过敏试验的方法学研究及适用性考察

目的研究大鼠皮肤类过敏试验方法的适用性和可靠性，对中药注射剂潜在的类过敏反应进行检测和评价。方法以C48／80为工具药物，对可能影响大鼠皮肤类过敏试验的灵敏度和可靠性因素进行比较研究，优选最佳试验条件，选用Tween80、内毒素、中华眼镜蛇毒素、天花粉蛋白注射液、痰热清注射液和血塞通注射液进行考察和应用。结果大鼠皮肤类过敏反应试验方法最佳条件为：采用胰岛素注射器（口径0．33mm）进行药物注射，50-100pL／点，给药后立即尾静脉注射0．5％伊文思蓝染液1mL，15min时颈动脉放血处死大鼠，剪取背部皮肤处理。采用该方法，Tween80、内毒素、中华眼镜蛇毒素、天花粉蛋白注射液均呈现一定的诱导大鼠皮肤出现蓝斑的能力，痰热清注射液给予临床剂量无蓝斑出现。血塞通注射液，临床剂量虽可引起大鼠皮肤蓝斑，但不排除与因其本身的药效作用干扰所致。结论该方法操作简便，试验周期短，需用药量少，检测敏感性高，结果重复性好，但易受药物本身特性干扰而出现假阳性。

补阳还五汤药物血清对自由基损伤的血管内皮细胞的保护作用

用血清药理实验方法观察了补阳还五汤药物血清对氧自由基（ＯｘｙｇｅｎＦｒｅｅＲａｄｉｃａｌ，ＯＦＲ）损伤的血管内皮细胞（ＶａｓｃｕｌａｒＥｎｄｏｔｈｅｌｉａｌＣｅｌ，ＶＥＣ）的保护作用。实验结果表明药物血清能够提高正常或损伤的ＶＥＣ增殖活力，减少ＭＤＡ的产生，使细胞分泌ＰＧＩ２、ＥＴ－１功能趋于正常。

石杉碱甲治疗血管性痴呆的有效性与安全性Meta分析

目的系统评价石杉碱甲治疗血管性痴呆的有效性与安全性。方法检索知网、维普及万方数据库1995~2017年期间发表的有关石杉碱甲治疗血管性痴呆的临床随机对照研究。采用Rev Man5.3软件,对所纳入研究的石杉碱甲治疗血管性痴呆的有效性和安全性进行分析。结果石杉碱甲能够显著提高血管性痴呆患者的简易精神状态智能量表(MMSE)的评分(P<0.000 01),显著改善患者的痴呆症状;能够显著降低血管性痴呆患者的降低日常生活能力量表(ADL)评分(P<0.000 01),显著改善患者独立生活的能力;治疗血管性痴呆的有效率比对照组更有效(P=0.000 3);治疗血管性痴呆的不良反应发生率比对照组更易发生(P<0.000 01),但无严重不良反应发生,多以轻微的胆碱能兴奋症状为主,一般可自行好转。结论石杉碱甲可显著改善血管性痴呆患者的记忆、认知功能和生活自理能力,与对照组比具有统计学意义,受发表偏倚影响较小;石杉碱甲虽有副作用发生,但症状较轻,一般不影响继续给药治疗。

薄荷油致大鼠肝毒性机制研究

目的考察川楝子致大鼠肝脏损害的毒性机制。方法将大鼠随机分组,薄荷油组口服薄荷油致肝毒性剂量2.4ml/kg,四氯化碳组口服四氯化碳2.5ml/kg,正常组给予同容积溶媒。给药36或48h后,取血,用ELISA法检测血清TNF-α、IL-6含量;取肝组织,用免疫组化法检测肝组织NF-κB、ICAM-1蛋白表达。结果(1)与正常组相比,薄荷油组与四氯化碳组大鼠血清TNF-α、IL-6含量显著升高(P<0.01)。(2)与正常组比较,薄荷油组与四氯化碳组大鼠肝组织NF-κB、ICAM-1蛋白表达显著增强(P<0.01)。结论大鼠一次性口服薄荷油2.4ml/kg,可引起血清TNF-α、IL-6升高,肝组织NF-κB、ICAM-1蛋白表达增强。炎症反应可能是薄荷油致肝毒性的机制之一。

山豆根致大鼠肝损伤外周血microRNA早期变化特征研究

目的探讨山豆根致肝损伤外周血微小RNA(microRNA,miRNA)的早期变化特征,寻找肝损伤早期外周血miRNA标志物。方法 60只Wistar大鼠随机分为山豆根组和对照组,每组30只,分别给予山豆根水煎液12g/kg(2mL/100g)和等容量蒸馏水灌胃。于给药3、7、14、28天和停药后28天分批处理动物,取血清,测定常规血液生化指标ALT、AST、TBIL、碱性磷酸酶(ALP)、总蛋白(TP)和白蛋白(ALB)水平,计算球蛋白(GLO)水平;取肝组织进行HE染色,观察病理形态学变化。同时分别取两组大鼠给药7、14、28天全血进行miRNA芯片检测,筛选差异表达miRNA,并进行RT-PCR验证。结果山豆根组给药7～28天ALT明显升高(P<0.05),组织病理学检查显示肝组织于给药28天出现肝细胞变性肿大。外周血miRNA芯片检测中,给药7、14、28天上调差异表达miRNA分别有11个、22个、13个,下调差异表达miRNA分别有1个、13个、2个。对给药7、14、28天共有差异表达miRNA通过靶基因预测和pathway分析发现,参与调控信号转导、细胞间相互作用、细胞骨架、免疫相关的差异表达miRNA可能参与了肝损伤的进程。时效高峰在7天的miR-291a-5p的RT-PCR验证显示,miR-291a-5p在外周血和肝组织的表达基本一致。结论 miR-291a-5p可在早期提示肝脏的损伤,可作为山豆根致肝损伤早期标志物之一。

商陆皂苷甲致肝毒性的研究

目的通过体外、体内实验相结合的方法考察商陆皂苷甲所致的肝毒性。方法 MTT法测肝细胞(L-02细胞)活力;以不同质量浓度的商陆皂苷甲与肝细胞共培养后,测细胞培养上清中的AST(谷草转氨酶)、ALP(碱性磷酸酶)和LDH(乳酸脱氢酶)水平,并在光镜下对细胞形态进行观察;Hoechst-PI双标染色观察细胞的凋亡和坏死情况;取KM种小鼠分为正常组和给药组,给药组的小鼠每天尾静脉注射10 mg/kg商陆皂苷甲,连续给药7 d,考察小鼠血清肝功能指标和肝组织的病理学变化。结果 MTT的结果显示,商陆皂苷甲能显著抑制肝细胞活力,其IC50为360.18μg/mL;400μg/mL的商陆皂苷甲能升高细胞培养上清中的AST、ALP和LDH(P<0.01)并使肝细胞出现变圆、减少和死亡的现象;300和350μg/mL的商陆皂苷甲能使肝细胞发生凋亡和坏死;体内实验表明,小鼠血清中的AST和ALT(谷丙转氨酶)水平均明显升高(P<0.01),小鼠肝脏多出现肝细胞多发灶性坏死及肝细胞再生现象。结论大剂量的商陆皂苷甲对肝脏具有一定的毒性作用。

清开灵、血塞通注射液类过敏反应研究

目的用RBL-2H3细胞初步评价清开灵、血塞通注射液类过敏反应,为完善中药注射剂类过敏反应的筛选提供实验依据。方法 MTT法测定2种药物对细胞生长的IC50;采用不同浓度药物、C48/80或培养液分别刺激细胞30 min,检测上清液中组胺、β-氨基己糖苷酶释放率;另取刺激后的细胞,观察其脱颗粒率及超微结构变化。取ICR小鼠进行类过敏试验,以含伊文思蓝的药物或生理盐水单次尾静脉注射30 min,记录每组耳廓蓝染的动物数、蓝染总耳数及耳廓伊文思蓝渗出量。结果离体实验显示,清开灵、血塞通注射液的IC50均为12.5μL/mL;2种药物在较高浓度均能促进细胞释放组胺和β-氨基己糖苷酶(P<0.05,P<0.01),呈一定剂量依赖性;形态上可见细胞表面绒毛减少,内部空泡状结构增加。小鼠类过敏试验显示,2种药物对动物耳蓝染率均为100%、伊文思蓝渗出量明显增多(P<0.01)。离体与整体实验结果一致。结论清开灵、血塞通注射液具有潜在的致类过敏反应性,RBL-2H3细胞模型用于中药注射剂类过敏性评价具有一定的参考应用价值。