分子技术在食源性致病微生物检测中的应用

食品中的病原微生物是影响食品安全的主要因素之一,传统的细菌分离、培养与鉴定繁琐复杂、周期较长,难以适应食源性疾病预防控制的需要,因而快速、简便、特异的检测方法成为研究的热点。近年来,随着现代生物技术的快速发展,新的分子生物学技术和方法不断涌现并被广泛应用于微生物检测,为传染病的流行病学调查、基因的多样性、微生物的生物学特性、微生物的致病性等各个方面提供了重要的信息。本文较为系统地介绍了利用分子生物学技术快速检测食源性致病微生物的方法,总结了核酸杂交技术、核酸扩增技术、基因芯片技术在致病性大肠杆菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、单核细胞增生李斯特菌等致病微生物快速检测中的应用现状,并简要阐述了这几种检测方法的利弊。

食源性金黄色葡萄球菌肠毒素基因及其表达检测

金黄色葡萄球菌作为一种常见人类病原菌,可通过各种途径污染食品,引发食物中毒。其中,金黄色葡萄球菌肠毒素(SE)的分泌会大大增加其侵袭性和致病力。通过对比肠毒素基因的携带及其表达情况,有助于进一步分析肠毒素表达的环境条件,为产肠毒素金黄色葡萄球菌的防范和控制提供理论和数据支持。本研究采用PCR和3M^TMTecra^TM微孔板法分别检测33株食源性金黄色葡萄球菌中5种传统肠毒素SEA^SEE基因的携带及表达情况,结果显示,该批金黄色葡萄球菌中SE基因的检出率为100%,携带率最高和最低的分别为seb(48.48%,16/33)和see(9.09%,3/33)。而其中SE蛋白得到表达的菌株仅为63.64%(21/33),这表明不是有SE基因携带就一定可以有相应毒素蛋白的表达,可能还需相应的系统调控和适宜的环境因素。

成都市生鲜猪肉MRSA分离株的流行特征分析

目的:分析成都市各地区生鲜猪肉样品中耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(Methicillin-resistant Staphylococcus aureus,MRSA)的流行特征。方法:对鉴定出的MRSA菌株进行SCC mec分型、spa分型以及多位点序列(MLST)分型分析,同时运用PCR技术对MRSA菌株携带的多种毒力基因、生物被膜形成相关基因、耐消毒剂基因以及耐药基因进行检测,并采用K-B纸片扩散法调查MRSA菌株的耐药表型。结果:本研究从297株猪肉源金黄色葡萄球菌中筛选出24株MRSA菌株,分离率为8.08%。MRSA菌株主要以ST88-IVa-t1376、ST59-IVa-t437和ST9-IVb-t3433型为主,携带耐药基因3~7个;所有菌株均表现出对氨苄西林和青霉素G耐药,并且存在多重耐药情况;分离菌株携带多种肠毒素基因,其中MRSA8和MRSA13菌株携带了完整的egc基因簇;MRSA分离菌株均携带clfB、eno、icaBC和sasG等生物被膜形成相关基因;携带耐消毒剂基因(qac A/B、qac C和qac G)的菌株占比为62.5%,其中以qacG为主要携带基因类型。另外,79.17%的MRSA菌株携带溶血素基因(hla、hlb),所有菌株中杀白细胞素基因(pvl)均未检出。结论:成都市猪肉源MRSA的流行可能存在一定的交叉污染,应加强动物源食品携带MRSA菌株的监测。

市售猪肉金黄色葡萄球菌的分离及菌株耐消毒剂基因的检测

研究市售猪肉源金黄色葡萄球菌的污染情况,测定季铵盐类消毒剂对分离菌株MIC范围,以及耐消毒剂基因携带情况。采集春夏季与秋冬季市售生猪肉样品576份,采用肉汤稀释法测定苯扎溴铵对分离菌株的MIC,采用PCR技术对分离菌株5种耐消毒剂相关基因(qacA/B、qacC/D、qacG、qacH、qacJ)进行检测。576份样品中分离得到297株金黄色葡萄球菌,总分离率为51.56%;其中,春夏季样品374份,分离出158株;秋冬季样品202份,分离出139株。苯扎溴铵对分离菌株的MIC在0.00125~0.01μg/mL,297株中168株检出携带耐消毒剂基因,总检出率为56.6%,qacA/B、qacC/D、qacG、qacH、qac J的检出率分别为2.36%、19.86%、40.74%、6.73%、0.67%。结果表明猪肉源金黄色葡萄球菌的分离率和菌株消毒剂抗性基因携带率较高,猪肉中分离的金黄色葡萄球菌对季铵盐类消毒剂敏感。本研究为市售猪肉金黄色葡萄球菌的防控及消除提供参考。

金黄色葡萄球菌新型耐热核酸酶(Nuc2)的定点突变与特性分析

本研究选取了F60、A62、T102和Y135这4个可能的关键位点,采用定点突变的方法成功构建了5个Nuc2的单点和多点突变体。体外表达并纯化这些核酸酶,对其活性、耐热性和二级结构进行测定。结果表明:经方差分析(p<0.05),T102M和F60A/A62L/T102M/Y135V的核酸酶活性与野生型相比较显著下降,并且F60A/A62L/T102M/Y135V的酶活性基本丧失;T102M和F60A/A62L的耐热性明显弱于野生型;T102M和F60V/A62L的二级结构中α-螺旋结构的含量明显低于野生型,F60A/A62L/T102M/Y135V的二级结构中包含有无规卷曲。因此,推断T102是维持Nuc2核酸酶活性、耐热性和二级结构稳定的一个关键位点;F60、A62、T102和Y135及其与邻近氨基酸之间的相互作用对维持Nuc2的性质稳定起着重要作用。

基于GB 4789.10-2016的银白色葡萄球菌鉴定方法的改进

探讨基于食品安全国家标准GB 4789.10-2016鉴定银白色葡萄球菌(Staphylococcus argenteus)的适用性,并提出相应的改进方法。采用GB 4789.10-2016第一法与PCR鉴定方法(目的基因为nuc1或NRPS)同时对193株金黄色葡萄球菌分离株和6株银白色葡萄球菌分离株进行鉴定,比较两者结果。结果表明,GB 4789.10-2016和nuc1-PCR方法将银白色葡萄球菌错误鉴定为金黄色葡萄球菌,而NRPS-PCR方法可以区分两者。研究表明:在GB 4789.10-2016的基础上,结合NRPS-PCR建立一套检验流程,可鉴定并区分金黄色葡萄菌和银白色葡萄菌。

上海市售海产品中副溶血性弧菌的分布状况

海产品中副溶血性弧菌引起的食物中毒已成为我国沿海地区细菌性食物中毒的首要病原。本研究中针对上海市闵行区某农贸市场的海产品开展为期1年的调查分析,共采集257份样品。按照国家标准(GB/T4789.7-2008),以硫代硫酸钠柠檬酸胆盐蔗糖培养基(TCBS)和科玛嘉弧菌显色培养基(CV)两种选择性培养基辅助分离副溶血性弧菌疑似菌株,结合生化试验和PCR方法对疑似菌株进行鉴定,从84份阳性样本中获得107株副溶血性弧菌分离株。其结果表明:该农贸市场市售海产品中副溶血性弧菌的污染率为32.7%,其中牡蛎中副溶血性弧菌污染率最高(达54.4%),蛤蜊和海瓜子次之(分别为33.9%,25.6%)。牡蛎中副溶血性弧菌的污染水平与季节性变化直接相关。对107株分离株的主要毒力基因tdh和trh进行PCR筛查,tdh阳性菌株为10株,trh阳性菌株为1株,并且此株菌为tdh、trh双阳性菌株,tdh和trh的携带率分别为9.4%和1.0%,tdh、trh双基因的携带率为1.0%。结论:市售海产品中副溶血性弧菌污染状况较为严重。这为政府相关职能部门开展食品安全防控提供了参考依据。

单核细胞增生李斯特菌食品分离株的分子分型鉴定

单核细胞增生李斯特菌是一种重要的食源性条件致病菌,不同亚型菌株的致病力存在较大差异。本文以86株单核细胞增生李斯特菌食品分离株为研究对象,采用多重PCR的血清分型方法 ,将这些分离株分为3个血清组,即:1/2a或3a(72.1%,n=62),1/2b或3b或7(19.8%,n=17),1/2c或3c(8.1%,n=7)。采用ERICPCR亚分型方法 ,将这些分离株和4株标准菌株分为10个类群。对比ERIC-PCR的指纹图谱与血清分型结果 ,两者呈现较高的相关性。将血清分型和ERIC-PCR方法相结合,可实现不同来源单核细胞增生李斯特菌食品分离株的同源性分析。这些分型结果为该菌的流行病学调查提供数据支持。

上海市食源性金黄色葡萄球菌环丙沙星耐药性的形成与gyrA,grlA基因突变的相关性

目的:探讨食源性金黄色葡萄球环丙沙星耐药性的形成与gyr A和grl A基因突变的关系。方法:采用纸片扩散法和E-test法测定来源于上海市的135株食源性金黄色葡萄球菌对环丙沙星的药物敏感性和最低抑菌浓度(MIC),采用PCR技术扩增gyr A和grl A基因并测序。运用同源比对方法分析敏感菌株和耐药菌株在这两个基因序列上的差异性。结果:135株食源性金黄色葡萄球菌对环丙沙星的耐药率达36.30%,gyr A和grl A的携带率均为93.33%,gyr A和grl A的突变率分别为37.30%和53.97%。结论:食源性金黄色葡萄球菌对环丙沙星的耐药性的形成与gyr A和grl A的突变密切相关,环丙沙星等喹诺酮类药物作用于金黄色葡萄球菌的首要靶位点是拓扑异构酶IV。如果仅grl A发生突变,则导致该菌株低水平耐药性的形成;如果gyr A和grl A同时发生突变,就导致金黄色葡萄球菌高水平耐药性的形成。

副溶血弧菌临床分离株的血清分型及毒力基因分析

副溶血弧菌是一种以鱼类、贝类等海产品为主要传播载体的嗜盐性食源性致病菌。近年来,由该菌引起的食物中毒病例呈明显上升趋势。本文采用11种O抗体和8种K抗体,针对来自舟山、宁波、上海浦东和金山的58株副溶血弧菌食物中毒临床分离株(2006-2009年)进行血清型及毒力基因分析。菌株血清分型结果表明:上述4地致病性副溶血弧菌以O3群和K6型为主,共分为22个血清型。其中主要流行株为O3:K6型,占67.72%(107/158);其次为O1:K6,O3:K68,O1:K25,O1:K56,O2:K3等。菌株的来源地分析结果表明:上海金山临床分离株的血清型最复杂,表现出明显的多样性;舟山血清型较单一。利用PCR方法对上述158株副溶血弧菌的主要毒力因子——耐热溶血素基因(tdh)和耐热相关溶血素基因(trh)进行检测,结果发现,其阳性率分别为96.84%(153/158)和3.80%(6/158)。其中(tdh+/trh+)6株,(tdh+/trh-)147株和(tdh-/trh-)5株。结论:杭州湾4地致病性副溶血弧菌流行菌株血清型为O3:K6,且不同地区血清型差异较大;除极少数菌株外,绝大部分菌株都携带tdh或者trh。

沙门氏菌耐药谱及质粒耐药基因的筛查

目的:分析不同来源沙门氏菌耐药性及其质粒耐药基因携带情况,从而揭示质粒耐药基因与菌株耐药性的对应关系。方法:对226株食源性及医源性的沙门氏菌分离株用试卡法测试其耐药性,按2012年美国实验室标准委员会(CLSI)指导原则的标准计算细菌对抗菌药物的耐药率(R),中介率(I),和敏感率(S),并对具有耐药表型和中介表型的非敏感菌株进行质粒耐药基因的筛查。结果:针对青霉素类抗生素进行筛查,耐氨苄青霉素的菌株达到15.9%(36/226),耐舒巴坦/氨苄青霉素达到12.8%(29/226);针对氨基糖苷类抗生素,耐妥布霉素的菌株达到6.2%(14/226),耐庆大霉素5.8%(13/226);针对喹诺酮类抗生素,耐环丙沙星的菌株达到4.0%(9/226),耐左氧氟沙星1.8%(4/226);针对头孢菌素类抗生素,耐头孢唑啉4.4%(10/226),耐头孢他啶和头孢曲松分别为2.2%(5/226),耐头孢替坦0.9%(2/226)。针对碳青霉烯类和除青霉素类、头孢菌素类以外的β-内酰胺类的筛查结果均为敏感。β-内酰胺类抗生素非敏感菌株中,质粒上β-内酰胺类耐药基因携带率为59.5%(50/84),其中CMY基因携带率为10.7%(9/84),OXA基因携带率为27.3%(23/84),TEM基因携带率为39.2%(33/84),PSE基因携带率为1.2%(1/84)。喹诺酮类抗生素非敏感菌株中,质粒上喹诺酮类耐药基因携带率为14.7%(5/34),其中qnrA基因携带率为11.8%(4/34);qnrS基因携带率为2.9%(1/34)。对喹诺酮类和氨基糖苷类抗生素非敏感菌株中,质粒上acc(6’)-Ib-cr基因的携带率为17.1%(7/41)。仅CMY基因在食源性和医源性分离株中的分布具有统计学差异(χ2=5.480,P<0.05)。结论:本研究涉及的沙门氏菌分离株中,对青霉素类抗生素耐药性较强,其次是氨基糖苷类、头孢菌素类和喹诺酮类。大多数耐β-内酰胺类抗生素的沙门氏菌菌株都携带相对应的质粒耐药基因,而耐喹诺酮类以及氨基糖苷类抗生素的沙门氏菌携带相对应的质粒耐药基因较少。

沙门氏菌血清型快速PCR鉴定方法的建立

通过传统玻片凝集试验对78株沙门氏菌进行血清型检测,结果将这些沙门氏菌分成以鼠伤寒沙门氏菌和肠炎沙门氏菌为主的21种血清型,其中沙门氏菌SJTUF10023证实为自凝菌,无法鉴定血清型。利用MLST可以较精确地预测、区分不同血清型菌株,聚类的各个分支与血清型基本呈对应关系(96.2%,75/78),其中有3株沙门氏菌(1株阿贡纳、1株阿伯丁和1株斯坦利)聚类结果与血清型不一致。根据O抗原(rfb基因簇)、H1抗原(fli C基因)和H_2抗原(flj B基因)分别设计引物进行PCR反应,并与测序相结合,对78株沙门氏菌进行血清型测定,结果仅1株伤寒沙门氏菌的H_2抗原出现假阳性结果,准确度达98.7%(77/78),且编号为SJTUF10023的自凝菌被鉴定为鼠伤寒沙门氏菌,说明该方法能够准确、快速检测沙门氏菌血清型,有望在沙门氏菌血清型鉴定中成为替代传统血清分型的方法。

不同来源副溶血弧菌分离株的遗传相关性分析

选取来自上海、宁波、舟山的109株临床、食品和环境分离株,对其进行血清分型和ERIC-PCR分型研究。通过玻片凝集反应进行血清分型,结果显示:在26种血清型中,O3∶K6和O4∶K8所占比例较高,分别为20.7%和19.5%,合计达40.2%;其次为O4∶K68,O1∶K25,O3∶K68,O3∶K25,O3∶K8和O1∶K6等。结合来源分析表明:环境分离株的血清型分布呈现出显著的多样性,与食品和临床分离株差异较大。采用ERIC-PCR基因分型方法,结合聚类分析比较各分离株之间的遗传相关性,结果显示:ERIC-PCR指纹图谱可将109株副溶血弧菌分为65个型,31个类群,分辨力指数为0.942。亲缘关系分析结果显示:不同来源的分离株可聚为一类,在基因水平上存在一定的相关性。本研究揭示了不同来源的副溶血弧菌血清型分布情况及遗传相关性,结合血清分型和ERIC-PCR分型可进行流行病学溯源,为副溶血弧菌的预防控制提供理论依据。

肠炎沙门氏菌在贮藏鸡蛋蛋清中生存动力学模型的建立

肠炎沙门氏菌能引发人类的食源性疾病,被污染的禽蛋是其主要的传播媒介之一。该菌在鸡蛋清中的生存状态与抗逆特征成为研究热点。本研究以在蛋清中存活能力较强的肠炎沙门氏菌分离株SJTUF 11336与较弱的标准菌株ATCC 13076为研究对象,分别将它们接种于经不同温度(4,25和37℃)和时间(0~30 d)贮藏的鸡蛋蛋清中培养,24 h后进行菌落计数,测定它们的存活率,分析鸡蛋贮藏条件对沙门氏菌存活率的影响,采用多项式拟合法建立相应的生存动力学模型。结果显示:在不同贮藏条件下,SJTUF 11336和ATCC 13076的存活趋势相似;鸡蛋贮藏温度越高,受试细菌在蛋清中的存活率越低;随着贮藏时间的延长,受试细菌在蛋清中的存活率呈先降低后升高的趋势;在37℃贮藏5 d的鸡蛋清中,两菌株的存活率均达到最低值,表明此时蛋清的抑菌效果最强。本研究建立的肠炎沙门氏菌在蛋清中的生存动力学模型可靠性高,模型预测值与试验数值具有较好的一致性,适合预测鸡蛋清中肠炎沙门氏菌的存活趋势。