二例Ⅰ型抗凝血酶缺陷症患者反复发生静脉血栓的分子机制研究

目的对2例Ⅰ型抗凝血酶（AT）缺陷症家系进行表型诊断、基因分析，并探讨其静脉血栓发生的分子机制。方法常规筛查凝血功能，凝血酶生成试验评估高凝状态。用ELISA法及稀释的蝰蛇毒法分别检测抗心磷脂抗体（ACA）及狼疮抗凝物质（LA）。用发色底物法或凝固法检测蛋白C、蛋白S和抗凝血酶活性（PC：A，PS：A及AT：A），用免疫比浊法检测抗凝血酶抗原（AT：Ag）。Western blot方法分析血浆中AT的含量及相对分子质量。用PCR方法扩增AT基因的全部外显子及侧翼序列，用DNA直接测序法进行基因分析，并对静脉血栓相关的基因多态性进行筛查。用定点突变法构建ATAla404Asp突变体表达质粒，脂质体介导瞬时转染293T细胞，检测细胞上清液和裂解液中AT：Ag。结果2例先证者的凝血筛查指标均未见异常，凝血酶生成试验显示先证者1的凝血酶生成潜力（ETP）和生成峰值分别为正常人的2．8倍和1．5倍，表明体内呈现明显高凝状态。PC：A、PS：A、ACA及LA检测均未见异常。先证者1、2的AT：A分别为45％和32％，AT：Ag分别为121mg／L和158mg／L。血浆Western blot结果显示2例先证者AT含量较正常混合血浆减少，但相对分子质量正常。基因分析发现2例先证者各携带一个杂合突变，分别为g．3291c—T（Thr9811e）和g．13863C→A（Ala404Asp），未发现静脉血栓相关的基因多态性。体外转染实验结果显示Ala404Asp突变质粒转染细胞的上清液和裂解液中的AT：Ag分别为野生型的4．8％和60．6％。结论Thi9811e和Ala404Asp两种AT突变与先证者1、2反复静脉血栓发生明显相关。其中Ala404Asp突变为国际首次报道。其分子发病机制研究显示Ala404Asp突变蛋白存在分泌障碍和细胞内降解增多，导致Ⅰ型AT缺陷症。