中药天花粉蛋白增强诱导CD4^(+)CD25^(+)Foxp3^(+)调节性T细胞数量和功能的初探

目的探讨中药天花粉蛋白(Trichosanthin,Tk)增强诱导CD4^(+)CD25^(+)Foxp3^(+)调节性T细胞(regulatory T cell,Treg)数量和功能的作用。方法研磨6-8周C57BL/6小鼠脾脏,裂解红细胞后得到单个脾脏淋巴细胞悬液,按5×10^(5)/mL细胞密度均匀接种在圆底96孔板,设空白组、对照组(增殖体系:1μg·mL^(-1) anti-CD3/28 mAb)、三个不同诱导方案组,培养7天后收集细胞运用流式细胞术检测CD4+CD25+Foxp3+Treg细胞比例以此确定最佳诱导方案;将低浓度Tk(0.25、0.5、1μg·mL^(-1))作用于诱导体系,7天后采用流式检测Tk对CD4^(+)CD25^(+)Foxp3^(+)Treg细胞比例的影响;Annexin V-PI染色法检测细胞凋亡情况;Western blotting法测定各组中Treg细胞特异性转录因子Foxp3蛋白表达情况;实时荧光定量PCR法检测转录因子Foxp3和细胞因子TGF-β、IL-10、IL-6、IFN-γ基因水平的表达;酶联免疫吸附法(ELISA)测定各组细胞培养上清中分泌IFN-γ和IL-10的浓度。结果与对照组相比,添加TGF-β(5ng·mL^(-1))诱导小鼠脾脏淋巴细胞生成Treg的数量和比例最高,此诱导方案最佳(P<0.01);与诱导组相比,低浓度中药天花粉蛋白可显著增强诱导CD4+CD25+Foxp3+Treg细胞数量和比例,呈剂量依赖性(P<0.01),且Tk需在诱导体系下发挥作用,单加不能诱导生成Treg细胞,此浓度Tk无细胞毒性;与对照组相比,诱导组和低浓度Tk组Treg特异性转录因子Foxp3蛋白和基因表达水平均显著上调(P<0.01),II型辅助性T细胞(Th2)分泌的炎症抑制因子IL-10、TGF-β基因表达不同程度上调,反之,I型辅助性T细胞(Th1)分泌的促炎因子IFN-γ、IL-6基因表达呈相反趋势下调(P<0.01);与对照组相比,诱导组和低浓度Tk组细胞上清中分泌的IL-10浓度显著增加,IFN-γ浓度明显降低(P<0.01)。结论低浓度中药天花粉蛋白可显著增强诱导CD4^(+)CD25^(+)Foxp3^(+)调节性T细胞,上调Foxp3和Th2型炎症抑制因子IL-10、TGF-β的表达,下调Th1型促炎因子IFN-γ、IL-6的表达,从而发挥免疫抑制功能。