PTEN对FoxM1可变剪接的调控及该过程在肿瘤细胞迁移中的作用

目的探讨10号染色体磷酸酶和张力同源蛋白(phosphatase and tensin homolog,PTEN)对叉头框转录因子M1(forkhead box M1,FoxM1)可变剪接的调控,以及该调控作用对肿瘤细胞迁移的影响。方法在人胚肾293T细胞,人前列腺癌DU145细胞,人结肠腺癌RKO细胞,人结肠癌SW480、SW620细胞中用短发夹RNA(short hairpin RNA,shRNA)敲低PTEN的mRNA水平。设计针对FoxM1及其亚型FoxM1B和FoxM1C的特异性引物,用实时荧光定量PCR(quantitative real-time PCR,qRT-PCR)检测FoxM1B和FoxM1C的mRNA表达水平在PTEN敲低前后的差异。在DU145细胞中分别过表达FoxM1B和FoxM1C,利用Transwell细胞迁移实验和划痕实验检测两者对肿瘤细胞迁移的影响。通过免疫荧光和双荧光素酶报告基因检测实验,探索FoxM1B和FoxM1C对肿瘤细胞迁移调控差异的潜在机制。结果①将293T、DU145、RKO、SW480和SW620细胞内的PTEN敲低后,qRT-PCR检测发现,与对照细胞相比,在PTEN敲低的细胞中FoxM1B的mRNA均显著增多,而FoxM1C的mRNA表现为减少或不变。PTEN敲低不影响FoxM1的转录水平,而影响FoxM1的可变剪接,促进了FoxM1B亚型的生成。②Transwell细胞迁移实验结果显示,与对照细胞相比,FoxM1B过表达组DU145细胞迁移数量增多(P=0.024),FoxM1C过表达组DU145细胞迁移数量减少(P=0.000)。细胞划痕实验结果显示,过表达FoxM1B的DU145细胞愈合能力显著增强(P=0.001),过表达FoxM1C的DU145细胞愈合能力减弱(P=0.021)。FoxM1B和FoxM1C对肿瘤细胞迁移具有相反的调节作用:FoxM1B促进肿瘤细胞迁移,而FoxM1C则抑制肿瘤细胞迁移。③FoxM1B和FoxM1C过表达,均未引起β连环蛋白入核。双荧光素酶报告基因检测实验发现FoxM1B和FoxM1C的转录活性没有差别,FoxM1B和FoxM1C在调控肿瘤转移方面的差异不是由β连环蛋白转位介导的。结论PTEN敲低影响肿瘤细胞内FoxM1的可变剪接,导致促迁移的FoxM1B表达增加,从而促进肿瘤细胞迁移。

消除小鼠肝脏冰冻切片自发荧光4种封闭方法的比较

目的通过对小鼠肝脏冰冻切片进行不同的封闭处理,探寻消除小鼠肝脏自发荧光的最佳方法,以降低对免疫荧光阳性信号的干扰,提高免疫荧光结果的准确性。方法(1)经脾静脉注射肝脏荷瘤裸小鼠:将Hepa1-6-GFP细胞通过脾脏注射方法使其在雄性无胸腺BALB/c裸小鼠肝脏定植,并将肝脏进行冰冻连续切片,对切片分别进行AB液(内源性生物素封闭液)、blocking、AB液+blocking、丙酮+AB液+blocking封闭处理,然后检测小鼠肝脏冰冻切片自发荧光。(2)C57BL/6小鼠:对C57BL/6小鼠肝脏进行冰冻连续切片,对切片分别进行上述4种封闭处理,用F4/80标记肝巨噬细胞(Kupffer细胞),然后检测小鼠肝脏冰冻切片自发荧光。结果肝脏组织冰冻切片免疫荧光染色时,4种封闭处理都可以减弱肝脏切片的自发荧光,但丙酮+AB液+blocking封闭处理效果最佳。结论丙酮+AB液+blocking联合应用对小鼠肝脏组织冰冻切片自发荧光的消除效果最好。

色谱与质谱参数的优化对免疫抑制剂定量灵敏度的影响

目的·考察色谱条件中的流动相及质谱离子源参数对环孢菌素A(cyclosporine A,CsA)、他克莫司(tacrolimus,TaC)、西罗莫司(sirolimus,SiR)及依维莫司(everolimus,EvE)4种常见免疫抑制剂药物的液相色谱-质谱分析定量结果的影响。方法·基于超高效液相色谱-串联质谱(ultra-high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry,UPLC-MS/MS)技术,通过改变流动相及离子源参数,评价不同参数设置对免疫抑制剂峰形及色谱峰响应的影响;通过考察标准曲线线性及最低定量限(limit of quantitation,LOQ)检验不同离子源温度下方法的灵敏度。结果·甲醇作为有机相能提供更窄的峰宽;水相中添加甲酸铵(ammonium formate,AF)能够明显提高色谱峰响应,高浓度的AF反而能一定程度地抑制色谱峰响应,因此选择5 mmol/L的AF作为流动相改性剂。离子源温度的优化能够明显改善色谱峰峰形和定量灵敏度,250℃下方法具良好的线性(r20.99)和灵敏度(LOQ=0.05 ng/mL)。结论·建立了基于UPLC-MS/MS技术的4种免疫抑制剂同步定量分析方法,并通过优化流动相及离子源参数便捷且显著地提高了定量灵敏度。该方法中AF的添加和离子源温度是影响定量分析的关键参数,这为基于液相色谱-质谱法的其他化合物的高灵敏度定量方法开发和优化提供新的思路。

蛋白Fbxw7α与P53相互作用的研究

Fbxw7α是SCF(SKP1-Cullin 1-F-box)蛋白泛素连接酶复合物的组分,它可以降解肿瘤中的许多原癌基因。在多种类型的癌症中均发现了Fbxw7α的突变,因此Fbxw7α被认为是癌发生中的肿瘤抑制因子。然而,Fbxw7α在细胞周期中的作用仍然有很大的未知性。本文在293T细胞中使用免疫共沉淀偶联LC-MS/MS方法,比较了野生型Fbxw7α和F-box缺失的不能与Cullin1形成SCF复合物的Fbxw7α突变体(?Fbxw7α)的相互作用蛋白,并发现关键细胞周期检查点P53与两种形式的Fbxw7α都具有相互作用。然而,Fbxw7α的异位表达没有抑制P53的表达,表明P53不是用于蛋白酶体降解的Fbxw7α的底物。另外,发现WT Fbxw7α和?Fbxw7α的表达诱导细胞周期停滞在G1期。综上,研究证明了Fbxw7α和P53之间的直接相互作用,并揭示了Fbxw7α调节细胞周期的新机制。

小泛素样修饰物蛋白酶3调控小鼠肺泡Ⅱ型上皮细胞自噬

目的探讨小泛素样修饰物(small ubiquitin-like modifier,SUMO)特异性蛋白酶3(SUMO-specific protease 3,SENP3)对小鼠肺组织细胞自噬的调控作用及分子机制。方法应用免疫荧光技术检测SENP3在肺组织细胞中的定位;对SENP3基因野生型C57BL/6J小鼠(SENP3^+/+)和SENP3基因敲除杂合子小鼠(SENP3^+/-)进行饥饿处理,诱导细胞自噬;应用免疫印迹法评估细胞自噬水平;应用电子显微镜观察和免疫荧光技术分析发生自噬的细胞类型;应用免疫共沉淀方法检测自噬相关分子卷曲螺旋状Myosin样Bcl-2相互作用蛋白1(coiled-coil myosin-like Bcl-2-interacting protein 1,BECN1)的SUMO化修饰。结果 SENP3在肺泡Ⅱ型上皮细胞中高表达。小鼠经饥饿处理后,肺泡Ⅱ型上皮细胞出现自噬现象,且SENP3^+/-小鼠较SENP3^+/+小鼠更明显。同时,肺组织样品中BECN1的SUMO2/3化修饰被SENP3去除。结论 SENP3抑制饥饿应激时小鼠肺泡Ⅱ型上皮细胞的自噬,并可对细胞自噬程度进行精细调控。

褪黑素在儿童睡眠研究中的应用及检测方法

褪黑素是一种具有多种生理作用的吲哚胺类激素,近年来其在评估昼夜节律及改善睡眠方面备受瞩目,儿童褪黑素研究也逐渐增多,但目前缺乏灵敏精确的儿童褪黑素检测方法。因此,本文主要就褪黑素在生命早期的特征变化、儿童睡眠研究中的应用及其采集检测方法进行综述,为临床处理儿童睡眠节律紊乱等睡眠问题提供一定的参考。

HRP与TMB显色用于流式细胞仪MoFlo Astrios^(EQ)单细胞分选的方法探索

该文应用流式细胞仪MoFlo AstriosEQ结合辣根过氧化物酶(horseradish peroxidase,HRP)与四甲基联苯胺(3,3′,5,5′-tetramethylbenzidine, TMB)混合显色原理,进行单细胞分选的方法探索。结果显示:分选不同数量的微球或者细胞导致两者显色反应呈现深浅不一的蓝色,而未分选的对照组为无色, D650值提示组间具有显著性差异;分选微球和分选细胞组间无显著差异。研究表明,该方法能够快速判断实际分选得到的微球或细胞数与理论设置是否吻合,为后续单细胞分选提供判断依据。另外,整个验证过程不需要额外的大型仪器,试剂常规、廉价,可作为今后单细胞分选实验的辅助手段。

小鼠骨髓造血干细胞的分离纯化及电镜观察

应用免疫磁珠分选结合流式细胞术与透射电镜术对小鼠骨髓造血干细胞进行了分离、纯化及透射电镜观察。结果显示,20只小鼠的骨髓细胞经分离纯化后,共收集到2×105个造血干细胞,纯度达95%以上;其形态类似于小淋巴细胞,呈单核,近圆形,直径约5~7μm,核大细胞质少,染色质电子密度不均,除了线粒体和一些囊泡外,较少见到其他细胞器。经分离纯化的小鼠骨髓造血干细胞纯度好、活率高,可制成透射电镜标本,并能清晰观察其超微结构特征。该研究方法试图找出小鼠骨髓造血干细胞在形态学上的特征,为后续研究提供实验基础,且对探讨造血细胞结构与功能的关系具有一定的应用价值。

流式细胞术在肿瘤相关成纤维细胞增殖检测中的应用

肿瘤相关成纤维细胞(cancer-associated fibroblast,CAF)是肿瘤组织中数目最多的一种基质细胞,对肿瘤的发生发展起着重要作用。该文利用流式细胞术(flow cytometry,FCM)对比分析肿瘤相关成纤维细胞和非活化成纤维细胞(non-activated fibroblast,NAF)两者在细胞增殖和DNA倍性等方面的差异。在细胞形态学观察和细胞计数的基础上,通过PI、EdU和Ki-67等染色后利用FCM进行定量检测,并采用GraghPad软件对获得的数据进行统计分析。研究表明,与NAF细胞相比,CAF细胞增殖减缓,细胞周期在G_(0)/G_(1)期被阻滞,其差异具有统计学意义(P<0.05)。该文首次利用FCM量化CAF细胞的生物学特性,尝试为进一步机制的研究提供理论依据。